构建稳定转染细胞株的简要步骤（细胞转染之稳定细胞株的构建）

细胞转染,简而言之，就是将外源分子（如DNA,RNA等）导入真核细胞中的一种技术。

分类：

瞬时转染（transient gene expression, TGE）和稳定转染(stable gene expression，SGE)两种。

瞬时转染

指外源 DNA或RNA 转入宿主细胞后不整合到宿主染色体中进行外源目的基因的表达。

特点：

1.目的基因未整合到染色体上，超螺旋质粒DNA有较高的转染效率；

2.转染24h-72h后常需要用到一些报告系统如荧光蛋白、β半乳糖苷酶等来帮助检测；

3.表达持续时间48-72h,随细胞分裂而稀释直至丢失；

4.用于快速分析:如基因产物短期表达、蛋白质小规模表达纯化。

稳定转染

指外源DNA转入宿主细胞后将外源目的基因整合到宿主染色体中进行表达。

特点：

1.目的基因整合到染色体上，需要使用线性DNA（线性DNA虽然比超螺旋状的DNA转入量低，但整合率高）；

2.外源DNA整合到宿主细胞染色体中大约为1%，通常需要通过一些选择性标记反复筛选，才能得到稳定转染的同源细胞系。

3.随宿主细胞基因组复制、转录、翻译，并被稳定遗传；

4.用于获得稳定表达的外源基因的单细胞克隆：如大规模蛋白质的合成，长期的药理学研究遗传机制的研究等。

构建稳定转染细胞株的简要步骤（细胞转染之稳定细胞株的构建）(1)

图1 细胞转染流程图

细胞转染的方法

物理法：电穿孔法、显微注射法和基因枪法；

化学法：磷酸钙共沉淀法、脂质体转染方法、多种阳离子物质介导；

生物法：病毒介导转染、逆转录病毒、腺病毒。

一些转染方法方法的比较

转染方法	原理	应用	特点
电穿孔法	高脉冲电压破坏细胞膜点位，DNA通过膜上形成的小孔导入	瞬时转染所有细胞	胞用量大，需要根据不同细胞类型优化电穿孔实验条件
显微注射法	用显微操作将DNA直接注入靶细胞核	稳定转染瞬时转染	转染细胞数有限，多用于工程改造或转基因动物的胚胎细胞
基因枪法	将DNA用显微重金属颗粒沉淀，再将包被好的颗粒用弹道装置射入细胞，DNA在胞内逐步释放表达	瞬时转染稳定转染	用于人的表皮细胞，纤维原细胞，淋巴细胞及原代细胞
磷酸钙法	磷酸钙DNA复合物吸附细胞膜被细胞内吞	稳定转染瞬时转染	不适用于原代细胞，操作简便但重复性差，有些细胞不适用
阳离子脂质体法	带正电的脂质体与核酸带负电的磷酸基团形成复合物被细胞内吞	稳定转染瞬时转染所有细胞	实用性广，转染效率高，重复性好，但转染时需要除血清。转染效果随细胞类型变化大
病毒介导法	通过侵染宿主细胞将外源基因整合到染色体中	稳定转染	可用于难转染的细胞、原代细胞，体内细胞等
逆转录病毒	通过病毒中膜糖蛋白和宿主细胞表面的受体相互作用而进入宿主细胞，之后反转入酶启动合成DNA并随机整合到宿主基因组中。	特定宿细胞	携带基因不能太大，细胞需要处于分裂期，需考虑安全因素
腺病毒	通过侵染宿主细胞将外源基因整合到染色体中	瞬时转染特定宿主细胞	可用于难转染的细胞，需要考虑安全因素