当地时间7月3日，世卫组织首席科学家苏米娅·斯瓦米纳坦在新冠肺炎例行发布会上表示，实验室研究发现，新冠病毒D614G变异可能导致病毒加速复制，意味着可能增强其传播性。今天就让我们从模式识别受体及免疫逃逸的角度来一起探讨病毒与宿主细胞之间的恩怨情仇。
什么是模式识别受体
模式识别受体（Pattern recognition receptors，PRRs）是机体先天免疫系统的重要组成部分，存在形式多样，不仅仅在细胞膜上表达，内体膜、溶酶体膜和胞质中也同样分布广泛。他们的作用是，监测病毒分子的存在、启动机体炎症反应和抗病毒免疫的信号传导通路，使宿主免受感染。病毒入侵宿主细胞后，利用细胞内的碱基成分产生新的病毒基因组，病毒复制中间体的形成和堆积，形成了病毒核酸的主要病原相关分子模式（pathogen-associated molecular patterns，PAMP），而这些分子就是PRRs所识别的对象。
PRRs包括Toll样受体TLR、RIG-I样受体（RLR）和NOD样受体（NLR），这些PRRs通过激活相关抗炎通路诱导细胞因子和干扰素的产生，从而激发机体的抗病毒反应。目前研究比较多的是通过PRRs监测受感染细胞内的病毒DNA，也有研究表明，RNA聚合酶III（Pol III）可将某些病毒DNA转录为RNA，而被宿主RIG-I识别受体所识别，诱导IFN的产生。
病毒激活宿主模式识别受体
病原相关分子模式主要是指病原微生物表面某些共有的高度保守的分子结构，比如TLR3识别dsRNA、TLR4识别LPS（脂多糖），TLR9识别CpG、RIG-I/MDA5（MDA5是胞内模式识别受体，能够识别入侵病毒RNA链，主要在非髓系细胞系中发挥抗病毒作用）识别病毒RNA等，但并不是严格的一一对应，如TLR4也可以识别某些病毒的蛋白。
图1. 宿主模式识别受体与病毒的相互作用（Kiva Brennan and Andrew G Bowie et al. 2010)
该图展示的是TLR、RLR和新型病毒的PRRs感测病毒的模式。箭头表示信号转导路径，转录因子IRF3和NFkB激活，炎性小体产生，最终诱导I型IFN和IL-1β的产生。星号表示每个PRRs在细胞内的位置：*，内体；**，细胞表面；***，胞质的；DBD，DNA结合域；TIR，Toll-interleukin-1受体域。
现在大家对识别病毒的模式识别受体及病原相关分子模式有了大概的认识，那么接下来我们看一下在胞膜和胞内的PRRs分别有哪些，他们又是怎样被激活的？
细胞表面TLR：TLR2和TLR4，二者是著名的监测胞外病原体的细胞表面TLR，大家熟知的TLR2识别的是细菌脂肽和各种真菌PAMP，而TLR4主要用来监测革兰氏阴性菌脂多糖。随着研究的不断发展，TLR2和TLR4被证明在脾脏和骨髓来源的细胞中对病毒的识别起主要作用，这条路径被认为是经典的抗病毒反应过程。例如TLR4在牛痘病毒（VACV）免疫中的功能缺乏，会大大增加小鼠的病毒复制能力以及死亡率。
传统意义上，胞内TLR（TLR3、TLR7、TLR8、TLR9）与细胞表面TLR相比，更能让机体发挥抗病毒免疫效应，因为他们能够识别病毒表面的核酸。研究发现，单疱疹病毒1（HSV-1）脑炎患儿的TLR3等位基因为负显性，中枢神经系统中TLR3的表达对于HSV-1的免疫非常重要。另有一项研究表明，TLR3可以识别疱疹病毒（EBV）中的单链非编码RNA，在被EBV感染的细胞中发现有EBV编码的小RNA（EBER）可以形成茎环结构，从而产生类似双链RNA（dsRNA）的分子，TLR3在识别EBER中具有重要作用，参与由EBV感染引起的免疫病理疾病。也有数据表明，TLR7对单链RNA（ssRNA）有反应，浆细胞、树突细胞对HIV-1编码TLR7的配体反应明显不同，这也是男女HIV-1病程差异的原因之一。
不同PPRs对不同病毒进行监测，激活机体产生炎性小体以及白介素等发挥抗病毒的功能：研究发现黑色素瘤2（AIM2）的表达可以促进炎性小体的产生；通过TBK1激活转录因子IRF3这条途径可以诱导IFNβ的产生，这里很典型的一个例子是鼠成纤维细胞中DAI的过表达可以增强I型干扰素的表达并诱导其他与DNA反应相关的先天免疫基因的产生。这些均表明，在病原体感染机体的过程中，PRRs被激活，诱发炎性通路等抗病毒反应因子的激活，而这些，对于后期募集免疫细胞对病毒进行攻击非常重要。
模式识别受体如何分辨敌友
病毒激活PPRs，抗病毒通路被激活，免疫反应启动病毒抗击模式，但是，PRRs是怎样将病毒核酸和自身核酸巧妙的区分开呢？如果不能区分开又会产生怎样的损伤效应呢？
我们已经知道病毒复制导致复制中间体在受感染细胞的细胞质中积累，诱发PRRs发挥功能，例如RIG-I样受体和各种其他的DNA传感器（DAI，DExD/Hbox家族解旋酶等），AIM2受体和cGAS，这些对胞质核酸敏感的PRRs引起机体局部抗病毒反应，先天性免疫细胞如树突状细胞（DC）被募集到感染部位，通过Toll样受体等感测感染性物质，监测PAMP并进行捕捉。PAMP介导的PRR调节DC活性被证明对启动针对入侵病原体的适应性免疫反应至关重要。通过PRR直接激活DC来确保只有与传染性生物体直接接触的DC和当前病原体衍生的抗原才具有诱导T细胞分化为效应细胞的能力。胞质PRR的识别对象是病毒核酸，且这类核酸具有哺乳动物核酸缺少的特征。例如RIG-1识别的短钝末端dsRNA结构上的5'三磷酸基团和MDA5识别的长dsRNA结构上没有的核酸。DAI（也称为DLM-1/ZBP1）最初被描述为一种Z-DNA结合蛋白，可识别病毒DNA，具有触发干扰素（IFN）基因刺激物（STING）上游的细胞质DNA传感的能力。TLR介导的核酸识别依赖存在于自身核酸中的分子模式。这表明免疫系统可以在正常情况下阻止自身核酸的刺激，但是在病理情况下，核酸敏感的PRR可以触发先天性免疫激活。因此，由自身核酸引起的异常PRR激活具有驱动自身免疫诱导的风险。
在这篇综述中，研究者将讨论免疫系统如何在内体TLR水平上区分病毒核酸和自身核酸，以及在生理条件下，由TLR介导的自身核酸感应驱动的预防自身免疫诱导的机制。一旦被募集到溶酶体区室，TLR在被驻留的pH依赖性蛋白酶切割后就具有功能活性。TLR到达溶酶体区室时被裂解，防止了其在细胞中其他位置定位，或在细胞表面上的自身核酸对核酸传感TLR的活化，目前认为，这是防止在生理条件下通过self-agonists对TLR异常活化的一种机制。但是，一旦TLR通过蛋白水解作用来发挥功能，它们就无法根据结构差异区分病毒核酸和自身核酸，但TLR3除外。TLR3以不依赖序列的方式识别病毒dsRNA，通过感染细胞中存在的基因组dsRNA或dsRNA复制中间体的形式来识别病毒dsRNA。因此，病毒dsRNA代表一种真正的PAMP，可让免疫系统区分病毒RNA和自身RNA分子。
图2. 摄取病原体和死细胞的机制（Eva Brencicova and Sandra S. Diebold, 2013）
来自病原体和死细胞的物质通过相同的摄取机制被细胞摄取，包括Fc受体、补体受体和清道夫受体介导的摄取。Fc受体和补体受体介导的摄取分别需要事先用抗体和补体因子进行处理，抗原呈递细胞（APC）活化受到物质来源和吸收途径的严格调节和影响。来自垂死的未感染细胞的物质摄取又激活了许多调节途径，这些调节途径减弱了促炎性免疫原性APC的活化。相反，病原体或病原体来源物质的摄取导致APC的促炎性免疫原性激活。也就是说，病毒入侵细胞，可以通过多种途径来逃避被PRR劫持的风险，而机体也进化出了各种PRRs机制，使得宿主能够有更好抗击外来物的能力。从这个角度来说，机体免疫是一个动态的进化过程，正确的识别可以帮助机体抗击病毒，而错误的识别则会造成自身免疫性疾病等危害。
而新冠病毒是否来得及应对机体PRRs的劫持，它的入侵会让宿主启动怎样的自身保护机制呢？
新冠病毒感染后由PRRs介导的免疫应答
研究者在一项回顾性的研究中发现，新冠肺炎重度患者总的T细胞数量明显减少，主要是介导抗原特异性免疫反应的记忆T细胞，而这也从一定程度上增加了新冠肺炎痊愈患者复发的可能。从PRRs识别病毒的角度来说，新冠病毒感染激活的抗病毒应答途径分别是NF-κB，JAK/STAT：
1. NF-κB/TNFα信号通路
转录因子NF-κB是先天免疫和适应性免疫的关键调节器。一般条件下，NF-κB被抑制蛋白IκBs保留在细胞质中。多种细胞刺激物，包括病原体，通过蛋白酶体诱导IκB磷酸化泛素化或降解，从而促进NF-κB核易位。在细胞核中，NF-κB诱导广泛的促炎因子、趋化因子、应激反应蛋白和抗凋亡蛋白的转录。NF-κB的活性对于病毒的存活和激活以及产生最佳免疫反应至关重要。据报道，NF-κB活化的加剧与呼吸道病毒（包括SARS-CoV）诱导的肺炎性免疫病理有关。有研究者研究表明，在鼠巨噬细胞系（RAW264.7）中，暴露于病毒的重组S蛋白后，上清液中IL-6和TNF-α呈时间和浓度依赖性地大量释放，IL-6和TNF-α分泌的增强，依赖于NF-κB的活化，而SARS-CoV-S蛋白与IκBα降解增加有关，这是激活NF-κB信号通路所需的必要步骤。因此，转染具有抑制NF-κB活性的显性失活因子NIK可以大大降低RAW264.7细胞中由S蛋白诱导的IL-6和TNF-α的分泌，从而证明NF-κB是SARS-CoV-S 诱导IL-6和TNF-α分泌的必经之路，体内，通过抑制TNF-α的表达，用如caffeic acid phenethyl ester-CAPE、Bay 11-7082、parthenolide等药物抑制NF-κB的活化，降低感染SARS-CoV小鼠肺部TNF-α、CXCL2、MCP-1的表达来减少炎症。此外，研究者用药物抑制NF-κB来保护病毒感染的小鼠肺部病理变化及存活率，实验证明感染SARS-CoV的老年猕猴肺部NF-κB活化增加了NF-κB核易位，并且发现年轻猕猴对病毒感染产生更强的宿主反应，且显著增加了NF-κB调节的促炎因子的表达。
图3. SARS-CoV-2驱动的信号通路和潜在药物靶标的示意图（Michele Catanzaro et al. 2020）
SARS-CoV-2感染诱导的细胞内信号通路。将作用于这些途径的选定药物重新用于调控由该病毒感染引起的细胞因子风暴。
2. IL-6/JAK/STAT信号通路：
JAK/STAT信号转导的主要激活剂之一是细胞因子IL-6，而在COVID-19患者中细胞因子IL-6显著增加，伴随着急性炎症反应和细胞因子风暴的发生。据报道，IL-6可以激活大量细胞来表达糖蛋白（gp-130）受体和结合IL-6的膜受体，可溶性的IL-6受体与gp130相互作用，从而促进下游JAK/STAT信号通路的激活。IL-6是由多种组织产生的，包括活化的巨噬细胞，内皮细胞和平滑肌细胞，在这些组织中IL-6分泌可以刺激巨噬细胞分泌MCP-1并促进动脉粥样硬化，增加细胞黏附分子的表达，刺激血管平滑肌细胞的增殖和迁移。因此，IL-6的异常升高可能涉及到COVID-19部分患者中观察到的心血管疾病（例如冠状动脉粥样硬化、血管系统炎症导致弥散性微血管病和血栓形成）的发生。目前已经证明，IL-6的合成和分泌是由血管紧张素II诱导的，而血管紧张素II是以JAK/STAT依赖的方式在发炎的血管中局部产生。SARS-CoV-2可能下调ACE2受体，导致血管紧张素II的过量产生，进而以AT1/JAK/STAT依赖的方式增强IL-6的产生，最终导致血管炎症和肺损伤等COVID-19感染的临床症状。血管紧张素II/AT1受体也激活NF-κB和ADAM17，而ACE2也是ADAM17的重要底物，据报道ACE2会被ADAM17切割而失活，而增强了血管紧张素II的存在，导致高血压、心血管等病理生理的发生。ADAM17除了对ACE2受体脱落有影响外，它也是病毒进入细胞的基础，ADAM17诱导可将IL-6受体α（IL-6Rα）的膜形式加工成可溶性形式（sIL-6Rα），随后gp130在多种IL-6Rα阴性非免疫细胞中通过sIL-6Rα-IL-6复合物介导STAT3活化，而STAT3的激活是需要由NF-κB通路的诱导。因此，SARS-CoV-2感染可能同时激活NF-κB和STAT3信号转导，促进STAT3过度激活NF-κB，从而放大IL-6效应，诱发多种炎症和自身免疫性疾病。
图4. SARS-CoV-2在IL-6和血管紧张素II之间建立炎症反馈回路的假设机制（Michele Catanzaro et al. 2020）
总结
PRRs对外来病原体PAMP、机体自身产生的蛋白质，或病理代谢产物的损伤相关模式分子（DAMP）进行识别取样，激活细胞内信号转导和基因表达程序，导致一系列细胞因子和趋化因子等介质产生，从而引起机体免疫反应。我们通过对PRRs的介绍，分析了PRRs与病毒PAMP之间的关联，并且回归到目前的新冠疫情，可以从免疫学的角度更深度的审视新冠病毒给机体造成的损伤机制，病毒变异株传染性和感染力的增强对我们研发疫苗提出了更多的挑战，如果我们可以将视野扩展到模式识别受体，是否会让疫苗和药物的研发拥有更新的思路呢？
参考文献：
1. Tan, L. et al. Lymphopenia predicts disease severity of COVID-19: a descriptive and predictive study. Signal Transduct. 2020.
2. Teijaro, J. R. et al. Endothelial cells are central orchestrators of cytokine amplification during inflfluenza virus infection. Cell. 2011.
3. Michele Catanzaro , Francesca Fagiani, Marco Racchi et al. Immune response in COVID-19: addressing a pharmacological challenge by targeting pathways triggered by SARS-CoV-2. Signal Transduction and Targeted Therapy. 2020.
4. Kiva Brennan and Andrew G Bowie. Activation of host pattern recognition receptors by viruses. Microbiology. 2010.
5. Andrew G. Bowie and Leonie Unterholzner. Viral evasion and subversion of pattern-recognition receptor signalling. Nature reviews| immunology. 2008.
6. Eva Brencicova and Sandra S. Diebold. Nucleic acids and endosomal pattern recognition: how to tell friend from foe? Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 2013.
7. Goubau, D., Deddouche, S., and Reis, E. S. C. Cytosolic sensing of viruses. Immunity. 2013.
8. Schwartz, T., Behlke, J., Lowenhaupt, K., Heinemann, U., and Rich, A. Structure of the DLM-1-Z DNA complex reveals a conserved family of Z-DNA-binding proteins. Nat. Struct. Biol. 8, 761–765. 2001.
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