从生物通上看到一篇文章,介绍原核表达菌株的选择。文章很好,是生物通从Merck(Novagen隶属Merck旗下)的网站上编译而成的。这里摘取其中我认为重要的地方,并添加了一些EMD (Emanuel Merck Darmstadt)原网站上的内容。仅供参考。

菌株活化原始记录(原核表达菌株的选择及菌种保存需知)(1)

在原核蛋白表达过程中,选择构建一个合适原核表达体系需要综合考虑3大因素:表达载体、宿主菌株、表达诱导条件,以获得最满意的表达效果。(如上图)

事实上,在平时的实验中,最容易被忽视的就是宿主菌的选择——多数人会直接选择自己实验室曾经用过的表达菌株,或者是载体配套的菌株,而不去追究原因——即使表达结果不佳,大多在表达条件和载体上找原因,也不会考究菌株的选择是否适合。

宿主细胞对原核表达可能会产生哪些影响呢?

菌株内源的蛋白酶过多,可能会造成外源表达产物的不稳定,所以一些蛋白酶缺陷型菌株往往成为理想的起始表达菌株。堪称经典的BL21系列就是lon和ompT蛋白酶缺陷型,也是我们非常熟悉的表达菌株。大名鼎鼎的BL21(DE3)融源菌则是添加T7聚合酶基因,为T7表达系统而设计。

真核细胞偏爱的密码子和原核系统有不同,因此,在用原核系统表达真核基因的时候,真核基因中的一些密码子对于原核细胞来说可能是稀有密码子,从而导致表达效率和表达水平很低。改造基因是比较麻烦的做法,Rosetta 2系列就是更好的选择——这种携带pRARE2质粒的BL21衍生菌,补充大肠杆菌缺乏的七种(AUA, AGG, AGA, CUA, CCC, GGA 及CGG)稀有密码子对应的 tRNA,提高外源基因、尤其是真核基因在原核系统中的表达水平。(已经携带有氯霉素抗性质粒)

当要表达的蛋白质需要形成二硫键以形成正确的折叠时,可以选择K–12衍生菌Origami 2系列,thioredoxin reductase (trxB) 和glutathione reductase (gor)两条主要还原途径双突变菌株,显著提高细胞质中二硫键形成几率,促进蛋白可溶性及活性表达。(卡那霉素敏感)

Rosetta-gami 2则是综合上述两类菌株的优点,既补充7种稀有密码子,又能够促进二硫键的形成,帮助表达需要借助二硫键形成正确折叠构象的真核蛋白。(卡那霉素敏感)

Origami B是衍生自 lacZY突变的 BL21菌株,这个突变能根据IPTG的浓度精确调节表达产物,使得表达产物量呈现IPTG浓度依赖性。(四环素敏感)

菌株活化原始记录(原核表达菌株的选择及菌种保存需知)(2)

菌株活化原始记录(原核表达菌株的选择及菌种保存需知)(3)

重组质粒和菌株的保存建议

在实验室里保存重组菌株的时候,为了挑菌和传代方便,我们常用LB平板保存在4℃冰箱中,需要提质粒和表达接种的时候,就直接从平板上挑菌,但是这种方法对于重组质粒的稳定性不利,容易出现质粒丢失、表达水平不稳定、菌株退化乃至发生污染等情况。 我们建议:

1、 长期存放菌株和pET重组子应该存在甘油-70℃保种。但是要注意高浓度甘油(> 10%)会导致质粒不稳定。请尽量保持甘油浓度8%。(15%浓度的甘油保种液和新鲜菌液1:1就行)2、重组质粒不宜长期保存于表达菌株(带DE3的大肠杆菌)中,请尽量使用带有recA endA突变的克隆菌株(比如C600,DH5a)进行质粒抽提和保存质粒。表达型的菌株提质粒经常会有质量不高或者背景的问题。

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