▋ 于德敏， 张欣欣
上海交通大学医学院附属瑞金医院
本文将近年来血清HBsAg定量检测指导临床慢性乙型肝炎诊治的最新进展做一汇总分析和评价。1 血清中检测到的HBsAg来源和形式
编码HBV包膜蛋白的基因分为前S1、前S2及S三个编码区，分别编码前S1蛋白（preS1），前S2蛋白（preS2）及HBsAg。三种蛋白形成了两种病毒分泌颗粒，一种是包含有病毒基因组和衣壳蛋白的称为成熟病毒（dane particle），其外面包裹有三种包膜蛋白（L蛋白、M蛋白和S蛋白）；另外一种是亚病毒颗粒，这些亚病毒颗粒直径22 nm，形状为球形或管状, 不包含病毒基因组和衣壳蛋白, 主要由病毒的M蛋白、S蛋白（最多）、极少量的L蛋白以及宿主细胞来源的脂质成分组成，由于不含病毒基因组，这些亚病毒颗粒没有感染性。
需要指出的是，与其他感染肝脏的病毒不同，HBsAg在其来源和存在形式上有其独特的几个方面，这些特点也影响到了HBsAg在临床诊治的应用。
（1）在HBV感染的患者外周血液循环系统存在的HBsAg有两种不同的来源：肝细胞内以游离微染色体形式存在的共价闭合环状DNA（cccDNA）和整合入宿主基因组的HBV基因组，因此血清HBsAg水平也同时受到两种形式的基因组水平影响，由于在慢性乙型肝炎的不同发病阶段，HBV基因组整合情况不同，如在HBeAg阴性的慢性乙型肝炎阶段基因组整合的发生率较高，此外整合的基因组也无法产生病毒复制，因此不同阶段中检测出的HBsAg结果与HBV DNA和肝细胞内的cccDNA水平的相关性也各不相同。
（2）在患者的血清中, HBsAg 亚病毒颗粒的含量远远超过Dane 颗粒, 为完整病毒颗粒的1000~1 000 000倍。甚至在检测不到病毒DNA 的情况下, HBsAg 仍能持续大量存在，并且目前商用的HBsAg检测试剂尚无法区分这三种形式的HBsAg。
（3）血清中HBsAg虽然由病毒基因组产生，但其滴度还受到机体免疫功能状况的影响，因此HBsAg水平及变化特征也可反映宿主的免疫功能状态。
2 血清HBsAg的定量检测方法
目前国际上应用较广泛的商用HBsAg定量检测试剂有Architect HBsAg QT (雅培诊断)、Elecsys Ⅱ（罗氏诊断)及Liaison XL Murex HBsAg quant (索灵)三家，这三家公司产品的HBsAg检测下限均为0.05 IU/ml，稀释后定量检测的上限可超过50 000 IU/ml，有研究对这些产品进行了比较，结果表明这些检测试剂的结果具有较好的一致性。但值得注意的是HBsAg基因组编码区的某些突变会干扰这些检测试剂的灵敏度，导致定量结果的降低甚至假阴性结果。
如最早报道的G
145R等发生在“α”抗原决定簇内的突变，本课题组前期对216例乙型肝炎免疫逃逸的患者进行了病毒基因序列分析，发现发生在主要亲水区的糖基化位点突变是我国HBV免疫逃逸的主要原因，这种突变可降低检测试剂的抗原抗体亲和力从而造成检测结果误差，对于这种检测误差对临床诊治的影响有待于进一步深入探讨。
此外，在抗病毒治疗中，由于抗病毒压力的影响可导致HBV逆转录酶发生突变，而该区域与HBsAg编码区几乎完全重叠，因此可能导致HBsAg产生继发突变，如基因D型的HBV发生常见的rtA
181T与rtM204I 突变后，在HBsAg编码区即分别产生sW172*和sW196*两种提前出现的终止码，导致HBsAg翻译终止，由此产生的HBsAg定量结果是否会影响临床诊治判断也需要深入探讨。
由日本Fujirebio公司研发的线性化（linearized）HBsAg 检测试剂由于可同时检测“α”抗原决定簇和位于脂质双层内的表位，其检测下限可达0.005 IU/ml，并且可能减少“α”抗原决定簇突变带来的干扰，但目前至少在国内未得到广泛推广。
3 血清HBsAg定量水平与慢性乙型肝炎的自然疾病进展的关系
3.1 血清HBsAg水平在慢性乙型肝炎自然病程中的动态变化
血清HBsAg水平与慢性乙型肝炎抗病毒疗效的关系研究开展较早，而相比之下对于在慢性乙型肝炎自然疾病进展过程中血清HBsAg水平变化的探讨相对晚一些，较早是在2010年由陈力元教授与Locarnini教授课题组分别报道，两项研究分别对220例和117例未抗病毒治疗的慢性乙型肝炎患者进行了追踪随访，此后国内外多名学者也从不同角度和人群进行观察分析。
当前的主要研究观点是：
（1）在慢性乙型肝炎自然史的不同阶段之间HBsAg的水平有明显差异，在免疫耐受期，血清中HBsAg的水平最高，多数研究认为在4.5~5 log10 IU/ml左右， HBV DNA也维持在较高水平（8 log10 IU/ml以上) ，进入免疫清除期后HBsAg与HBV DNA水平开始下降，并在获得HBeAg血清学转换后继续缓慢下降（
（2）在HBeAg阳性患者中，HBsAg水平与肝内cccDNA 具有较好的相关性（r=0.71），而在HBeAg阴性患者，血清HBsAg水平与肝内的cccDNA水平则无明显相关性。这也说明在HBeAg阴性阶段，HBsAg有相当的比例来源于整合的HBV基因组。在免疫清除阶段，血清HBsAg水平与HBV DNA载量的相关性最强，但与ALT的相关性不大，这一点也符合机体免疫清除的机制，除了直接破坏被感染肝细胞外，非细胞毒性的病毒清除机制也起到了很大作用。
（3）HBsAg水平与HBeAg自发性清除的发生无明显相关性。目前，尚无法以HBsAg水平预测患者能否自发性HBeAg清除。
3.2 血清HBsAg定量检测对于HBeAg阴性患者病情活动的诊断
HBeAg阴性阶段一般包括非活动携带状态和HBeAg阴性慢性活动性肝炎两种情况，前者提示乙型肝炎病情得到较好控制，具有较低的肝硬化和肝癌的发生风险，而后者则在必要时给予抗病毒治疗以降低上述并发症的发生危险。根据目前各大指南建议，两者的区分依据主要依靠HBV DNA水平和ALT水平，HBV DNA以HBV DNA低于检测下限或处于低水平即＜2000 IU/ml作为判断标准。但是由于在很多HBeAg阴性的慢性乙型肝炎患者中，其HBV DNA和ALT水平具有很大的波动性，特别是HBeAg阴性慢性活动性肝炎阶段，仅依赖单次的HBV DNA和ALT水平极易造成误判断。
如著名的HBsAg临床研究课题组GPs-CHB Study Group的一项研究中，对292例HBeAg阴性且ALT正常、HBV DNA＜2000 IU/ml的患者进行了随访，结果发现1年内有35%患者出现了HBV DNA>2000 IU/ml和（或）ALT升高而诊断为肝炎活动；而另一方面活动性肝炎的患者如果HBV DNA＜5000 IU/ml，并且HBsAg定量水平在1年内下降超过0.5 log10 IU/ml，则第2年转为非活动携带状态的概率较高。此外，在感染前C区突变或基本核心启动子区突变株的患者，也容易误诊为非活动携带状态，因此在临床诊治中需要对HBeAg阴性患者进行密切随访才能准确鉴别。
从HBsAg的来源及其与机体免疫状态的关系来分析，联合HBsAg的定量检测有助于准确区分两种疾病的进展阶段，从而尽早确诊活动状态患者，进行密切随访和尽早抗病毒干预有很好的应用价值。
临床研究人员尝试联合HBsAg定量检测进行单次检测以确诊非活动携带状态，目前多个研究证实了单次HBsAg联合HBV DNA定量检测的确可以较好的区分两种疾病阶段。前述的研究中，作者发现在单次检测中HBsAg＜100 IU/ml且HBV DNA＜2000 IU/ml的ALT正常水平患者，在长期的随访过程中均保持稳定的非活动状态。
此外，来自REVEAL队列的大样本量研究对
1529例HBeAg阴性及ALT正常的HBV基因B或C型慢性乙型肝炎患者进行了18个月的随访观察，以明确非活动携带或活动性肝炎患者，研究发现这些患者基线时的HBsAg＜1000 IU/ml联合HBV DNA＜2000 IU/ml对非活动携带状态的阳性预测值为83%，诊断准确率为78%，而HBsAg＜100 IU/ml则被认为与HBsAg的自发清除相关。提示这种单次的基线检测在区分非活动携带或活动性肝炎中的优势。
其实相比前述的HBsAg＜100 IU/ml诊断标准，HBsAg＜1000 IU/ml及HBV DNA＜2000 IU/ml的报道则更为广泛，早在2010年就已经有研究者在基因D型慢性乙型肝炎与非活动携带者中进行了研究，其阳性预测值为90%。另一项对251例患者的观察研究也证实了这个阈值对非活动携带者的诊断阳性预测值为98.7%。
3.3 血清HBsAg水平与肝纤维化和肝癌发生进展的关系及预测价值
肝纤维化的无创诊断模式及其应用一直是临床工作者长期
关注的问题，如APRI和FIB-4是两种在慢性乙型肝炎患者中应用较多，且被2015年世界卫生组织型肝炎防治指南所推荐的肝纤维化无创诊断血清学标志物，但仍然存在一些应用缺陷，如FIB-4中包含ALT和AST，其结果会受到肝炎急性发作等其他会使转氨酶升高的疾病影响。并且目前应用的很多诊断模型都是基于HCV感染者建立，因此将HBV病毒标志物纳入HBV相关肝纤维化的诊断模型将有助于提高诊断效能。
HBsAg定量对于HBeAg阳性慢性乙型肝炎患者肝纤维化的诊断最早是2012年Steo等报道，通过对
Martinot-peignoux等观察了406例HBeAg阳性未治疗的慢性乙型肝炎患者，在肝穿刺的同一天进行病毒学指标检测，结果显示肝纤维化严重的患者HBsAg和HBV DNA水平低于无或轻中度肝纤维化患者，模型分析显示将血清HBsAg的定量结果3.85 log10 IU/ml定为阈值可以很好的诊断显著性肝纤维化，其敏感度和特异度分别为100%和86%，阴性预测值达到100%。随后此课题组再次观察了710例HBeAg阳性基因B/C型的慢性乙型肝炎患者，并建立了2种肝纤维化无创评分系统，这2种系统的评估参数均包含了HBsAg定量，其中一项系统仅通过定量检测患者HBsAg水平并联合年龄即可较好的区分纤维化F0与F2级的患者，其HBsAg阈值设为17 500 IU/ml（4.24 log10IU/ml），年龄以30岁为界限，其敏感度和阳性预测值几乎达到了95%和97%。
国内Liang等对129例HBeAg阳性且ALT小于2倍正常值上限的慢性乙型肝炎患者进行了分析，患者均进行了肝活组织检查和肝弹性检测，同时将病毒学指标如HBsAg水平，HBV DNA水平等进行关联分析，结果表明在HBeAg阳性并且ALT小于2倍正常值上限的慢性乙型肝炎患者中，高滴度的HBsAg（>10 400 IU/ml）可以预测患者的纤维化低于F2级。
施军平教授课题组观察了197例肝组织穿刺后的HBeAg阳性慢性乙型肝炎患者，发现HBsAg和GGT水平是预测显著性肝纤维化的独立预测因素，进一步采用两者的比值GqHBsR进行预测，显示其敏感度和特异度分别为78.9%和
4 HBsAg定量在慢性乙型肝炎抗病毒治疗过程中的应用
早在
1994年Janssen等就动态观察了86例以普通干扰素治疗的慢性乙型肝炎患者的血清HBsAg、HBV DNA和HBeAg水平变化，发现HBsAg水平改变与后两者有很好的一致性，认为监测抗病毒治疗过程中血清HBsAg是一种有效易行的监测抗病毒疗效的方法。此后HBsAg定量检测也逐渐成为慢性乙型肝炎抗病毒治疗的检测项目，其应用范围随着治疗策略和药物研发的不断进展而扩大。
4.1 HBsAg定量对于干扰素抗病毒应答疗效的预测
在当前的各大慢性乙型肝炎指南中，HBsAg的清除伴或不伴抗HBsAg抗体的出现是最佳治疗终点。在HBsAg水平与抗病毒治疗应答的关系中，由于核苷（酸）类似物（NAs）与干扰素抗病毒治疗机制的不同，HBsAg的临床应用意义在两种治疗方案中也有区别。干扰素具有很强的免疫诱导功能，因此除可以抑制病毒复制外，对于包括HBsAg在内的病毒抗原也具有明显的抑制作用，同时血清HBsAg水平及其下降程度也反应了机体抗病毒免疫功能的强弱，继而也反映了肝内cccDNA和HBsAg的水平。
近年来样本量最大的研究来自一项对全球803例以PEG-IFN治疗的HBeAg阳性患者的报道，研究者发现在治疗12周时，血清HBsAg ＜
早在2009年，即有学者观察了48例HBeAg阴性患者PEG-IFNα-2a治疗早期血清HBsAg滴度下降对发生SVR的预测价值，结果显示在治疗12周血清HBsAg下降0.5 log10IU/ml和24周HBsAg下降1 log10IU/ml对SVR有较高的预测价值，其12周和24周阳性预测值分别为89％和92％，治疗期间发生HBsAg清除者全部获得SVR，而治疗中及治疗结束时HBV DNA水平下降则无预测价值。此后许多临床研究者也进行了后续研究，得出了类似结论。
Marcellin等对PEG-IFNα-2a治疗的HBeAg阴性慢性乙型肝炎患者进行了5年随访观察，研究认为治疗12周和24周HBsAg水平下降超过基线10%的患者，在48周后停药5年分别有22.6%和22.4%发生HBsAg清除，远高于12周和24周HBsAg下降幅度低于10%的患者发生率（7.5%和3.8%）。
4.2 HBsAg定量对于终止干扰素治疗的判断
由于IFN治疗的副作用、注射治疗的不方便以及费用问题，尽早准确的确定那些对治疗不会产生应答的患者并及时停止治疗，是近年来临床治疗比较
2019年一篇报道系统综述了近年来终止PEG-IFN治疗的各种评定标准研究，共纳入
对于HBeAg阴性慢性乙型肝炎患者的IFN终止治疗，目前的研究仅有基因D型患者的数据，即PEG-IFN单药治疗12周时HBsAg无下降并且HBV DNA下降小于2 log10的患者也被认为可以终止治疗，有学者推断采用这种标准可以最多使20%的患者避免不必要的抗病毒治疗。
4.3 HBsAg定量对于NAs抗病毒应答疗效的预测
与IFN不同，在NAs的治疗过程中由于NAs并不直接作用于cccDNA，因此NAs治疗的患者HBsAg下降较IFN治疗缓慢，HBsAg清除更为少见，治疗期限也更长（根据数学模型推算约为36~52.2年)。
目前报道认为，在前期有过IFN治疗、HBeAg阳性、ALT升高明显、病毒基因A型的患者中血清HBsAg下降较快，而HBeAg阴性患者下降则缓慢，除机体免疫功能因素外，也可能与HBeAg阴性患者体内整合形式的HBV DNA较多有关。在NAs治疗过程中，HBsAg下降越快，提示免疫功能对病毒的抑制和清除作用越强，继而更快达到满意的治疗终点。
一项来自替比夫定治疗慢性乙型肝炎的临床研究显示，在第1年HBsAg下降超过1 log IU/ml的32例患者第3年有8例发生了HBsAg清除，而第1年HBsAg水平保持稳定的56例患者则无1例HBsAg阴转，作者认为与T淋巴细胞的抗病毒活性激活有关。
另一项开放多中心的恩替卡韦单药/联合替诺福韦酯治疗的BE-LOW研究中，通过对3
在近年来对于恩替卡韦或替诺福韦酯抗病毒治疗的几项临床研究中，均观察到在HBeAg阳性慢性乙型肝炎的NAs治疗过程中，对HBsAg的定量检测可较好的预测病毒学应答或HBeAg血清学转换的发生，替诺福韦酯治疗的患者中治疗6个月时HBsAg的下降幅度（≥ 2 log10IU/ml）在对HBsAg的消除有预测价值。但是需要注意的是目前很多研究结果来自基因A或D型，在基因B或C型感染者中，NAs治疗后HBsAg清除率非常低。
在HBeAg阴性患者的应答预测方面还没有完全一致的结论，目前一些临床研究分析认为基线时低HBsAg水平（＜
4.4 HBsAg定量检测与NAs耐药突变的关系
除预测应答疗效外，对于NAs治疗过程中HBsAg的监测还有助于及时发现耐药突变株和判断病毒学突破，尽管当前各大指南均推荐强效和高耐药屏障的NAs如恩替卡韦、替诺福韦酯和替诺福艾拉酚胺作为一线抗病毒治疗药物，但在我国的一些欠发达地区仍有相当患者服用拉米夫定、阿德福韦酯等低耐药屏障的药物治疗，因此及时发现耐药突变株的出现并尽早处理是这些患者抗病毒治疗取得疗效的重要因素，在诸多的监测因素中，HBsAg的定量检测具有一定的优势。
如有报道发现拉米夫定治疗过程中，HBsAg滴度的增高出现在耐药突变株之前，另外在HBeAg阴性患者中拉米夫定开始治疗6个月如果HBsAg下降小于0.7 log10IU/ml预示将要发生病毒学突破，其阴性预测值为100%。另一项对HBeAg阳性慢性乙型肝炎队列研究显示，对于以拉米夫定治疗6个月HBV DNA阴转的患者，基线时HBsAg超过≥20 000 IU/ml是3年内发生病毒学突破的独立预测因素。
4.5 HBsAg定量与NAs抗病毒治疗停药
NAs治疗慢性乙型肝炎面临的另一个重要问题是如何选择哪些患者可以安全停药而不出现复发。尽管很多指南中均给出了NAs治疗的停药建议，如在HBeAg阳性患者获得持续的HBeAg血清学转换和HBV DNA不可测，巩固治疗至少12个月以上，可以考虑停药，但在实际临床治疗中根据此标准停药后复发仍然常见。HBeAg阴性患者的停药标准在美国肝病学会和亚太肝病学会指南中认定为在HBsAg消失后，这意味着更长时间的治疗期限和更少患者能够顺利停药。但由于长期服药带来的诸多问题，如何在HBsAg清除前就确定能够准确预测停药复发的生物学指标逐渐成为了慢性乙型肝炎抗病毒治疗研究的另一热点问题。
Qiu等曾对112例以恩替卡韦治疗符合停药标准的HBeAg阳性患者进行了停药随访观察，1年内出现病毒学复发达近50%，多因素分析认为在HBeAg血清学转换时HBsAg的2.5 log10IU/ml水平是预测停药1年内是否出现病毒学复发的较好指标。
Wang等在117例恩替卡韦治疗后停药的慢性乙型肝炎患者随访研究中发现，停药时HBsAg＜100 IU/ml预示3年内病毒学复发率较低，其中也包括了HBeAg阴性的患者。
综合近年来的HBeAg阴性临床研究的数据分析，抗病毒治疗疗程不低于3年并且HBV DNA阴转在2年以上的，如果停药时HBsAg保持低水平将有助于停药后保持稳定的抗病毒应答，HBsAg的阈值与抗病毒药物、HBV基因型和研究纳入的人群有关，另外如前所述，HBeAg阴性患者肝内HBV基因组整合也会产生影响，从目前研究结果看HBsAg的阈值在10~200 IU/ml。值得注意的是，早期有关于拉米夫定抗病毒治疗的研究发现除HBsAg水平外，治疗过程中血清HBsAg的下降幅度也可预测病毒学停药复发，但是对于恩替卡韦和替诺福韦酯治疗的患者目前尚缺少大样本量的研究。
HBsAg是最早被认识和应用的HBV病毒标志物之一，虽然近几年新的HBV感染诊断治疗的标志物如HBV RNA、HBcrAg等不断出现，这些新型标志物在一些临床研究中特别是HBV DNA不可测的情况下获得了很好的验证效果，但HBsAg定量检测在慢性乙型肝炎临床诊疗的应用价值并没有被替代。相反随着检测技术的不断改进和提高，抗病毒治疗策略的调整，特别是“功能性治愈”概念的提出和广泛接受，HBsAg定量检测的作用进一步受到重视。但从目前现有的研究结果来看，仍然还有一些问题期待解决，如HBsAg在HBeAg阴性慢性乙型肝炎抗病毒治疗应答和停药的作用还缺少足够样本量的研究，能否进一步明确HBsAg水平与宿主免疫功能的关系，HBsAg联合新型标志物在慢性乙型肝炎诊疗的应用目前尚不如联合HBV DNA应用成熟，如何克服发生在抗原表位的突变对HBsAg定量的影响等方面还需要进一步开展临床和基础研究来解决。点击下方“
阅读原文”，下载本文完整PDF
引证本文：于德敏, 张欣欣. 血清HBsAg定量检测慢性乙型肝炎临床诊疗[J]. 临床肝胆病杂志, 2019, 35(10): 2
本文编辑：王莹
公众号编辑：邢翔宇
,
