过去，实验室一直依赖水银灯或氙灯作为荧光和明场显微镜的光源。近年来，越来越多的研究人员选择改用LED光源。本文中我们就选用LED光源都有哪些优点以及该如何选择LED光源展开说明，并简单介绍几个LED光源在很多新兴技术上的应用。
大纲一）LED光源的优势
二）选择适合的LED光源
三）LED光源在新兴技术上的应用
1，LED光源的优势相比较传统的水银灯或氙灯光源，LED光源有如下一些优点：
1LED的成本更低，更节能，寿命更长
一般来说，水银电弧灯的寿命约为200小时，而且这个数字还受启动次数的影响，更换灯泡的成本也很高。LED光源中的LED芯片则不需要更换，可以持续稳定使用10,000小时或更长时间。另外，LED光源不需要预热，可以即时启动工作。
Fig. 1 UHP-F
2LED的光线更加均匀
水银灯的光在中间最亮，越往两边会变暗，形成了边缘不均匀、倾斜的景象，这样对最后的成像带来非常大的影响。而LED的亮度在整个视野中是均匀的，这对于在物镜下获得样品的高质量图像极为重要。
3LED更环保
汞对人类、野生动物和环境都有极大的危害，如果处置不当，对环境产生极大危害，而LED则不存在此类对人体和环境污染的风险。
2，选择适合的LED光源在考虑将荧光显微镜升级为LED光源时，有哪些事情需要注意呢？有些问题是很明确的，比如选择一个特定的光谱。但有些问题可能并没有注意到，但对后期的使用可能产生很大的影响，这里总结了一些需要重点考虑的因素：
1哪些因素决定了多少光会到达物镜
有四个主要因素决定了有多少光能照射到显微镜物镜上：
1）LED的功率
2）LED发光面积
3）发散角度
4）光束直径
Fig. 2 UHP-T-460
你需要的是功率最高的LED，同时具有发射面积最小，准直度最小以及合适的光束直径以保证光线充满光路而不会过满。这些因素将决定有多少有用的光能照射到物镜。在比较不同的LED时，请记住这一点：LED表面以mW/mm^2为单位的功率越高，就越有机会在你最需要的地方（即物镜下）获得更多的光。
基于阵列的LED（即多颗LED芯片）通常具有较大的发光面积，而且光线不均匀。而单发光体LED（即单颗LED芯片）的发光面积较小，发散度较低。
Fig. 3 基于单颗芯片的LED光源
2LED光源是否有很强的电磁干扰？
有些LED光源会从LED或电缆上发出电磁干扰。这将会影响到对电磁干扰要求极高的电生理应用。
所有的Prizmatix UHP-T型号的LED都经过特别优化设计，可直接安装在显微镜上，减少电磁干扰对实验的影响，特别适用于精密的电生理学。
3LED是否可以用于高速成像？
LED驱动器电子设备通常具有一个锯齿状的边缘，导致LED亮度会有波动，最高可达10％的亮度变化。对于低速成像来说这不是问题，因为光线会随时间被平均。但是，对于每秒数千帧的高速成像，这些波动会在图像中产生很明显的噪音。因此，在选购LED光源时要确认是否需要具有此功能。
Prizmatix LED采用特殊低噪音驱动器，已成功地用于高达每秒50万帧的成像，噪声可低至0.1%。如果您的应用需要非常安静的光学输出，请务必与我们的顾问联系，以获得低噪音LED光源。
4是否能和光纤一起使用或直接使用
这正是Prizmatix LED的优势所在。Prizmatix LED的模块化设计使其真正实现了多功能甚至多波长模式。Prizmatix主要使用高NA值的POF光纤或者液态光波导，实现很高的转换效率。
3，LED光源在新兴技术上的应用我们一起分享几个利用超高功率LED光源解决实际问题的具体案例。
应用
1. 电压敏感染料成像
2. 高光谱成像
3. 光遗传学和斑马鱼
4. 培养箱内的光刺激
5. 核磁共振波谱
6. OptiBlocks模块化设计
01电压敏感染料成像
电压敏感染料（Voltage-sensitive dye，VSD），也称为电位染料，是响应电压变化而改变其光谱特性的染料。它们能够提供单个神经元、神经元种群或心肌细胞放电活动的线性测量。许多生理过程都伴随着细胞膜电位的变化，而VSD可以检测到这种变化。测量的结果可以指示动作电位起源的位置，并且可以获得动作电位速度和方向的相关信息。
VSD用于监测无法插入电极的细胞器内部的电活动，例如线粒体和树突脊，这也使得沿着单个细胞表面的膜电位的空间和时间变化的测量成为可能。VSD会根据膜电位改变其吸收或发射荧光，从而使科学家能够测量神经元的整体电学状态。与细胞外电生理技术不同，除了spike放电活动，VSD还可以检测亚阈值的突触电位。
VSDI（VSD imaging，VSDI）技术就利用了VSD的这种电学特性，通过高速摄像机将细胞的电活动可视化，具有高空间分辨率（低至20-50um）和高时间分辨率（低至毫秒），有了这样的分辨率，可以用来研究单个神经元或者群体神经元的放电活动。
Fig.4 神经元群体中的全光学控制和抑制作用的检测。
（A）左-VSD染色的小脑切片的荧光图像，指示浦肯野细胞层（PCL），分子层（ML）和颗粒细胞层（GCL）的位置。右–在整个显微镜视野内，光刺激ML中间神经元产生的VSD信号。迹线指示在左侧图像中指示的3个编号位置处检测到的信号。（B）在光刺激ML中间神经元后的各个指示时间产生的VSD荧光变化的图像。荧光的变化（ΔF/ F0）由右侧所示的伪彩色标尺指示。
参考文献：
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0168010212002325?via=ihub
02高光谱成像
高光谱显微镜（Hyperspectral-Microscopy imaging，HSI）是一种先进的可视化技术，它将高光谱成像与最先进的光学和计算机软件结合起来，能够快速识别微观和纳米尺度的材料，还可以用来定位、鉴定和表征它们。
这里所说的高光谱，指的是测量的波长范围，通常包括近红外、可见光，有时还包括近紫外光谱。其原理是将分光光度计和成像技术结合起来：先进的光学技术和算法可以捕获每个像素的整个光谱，而不是拍摄每个像素的单一主导波长的照片。由于这给本来是二维的图像增加了另一个维度，高光谱图像有时被称为数据立方体。通过收集参考材料的光谱，可以将这些参考光谱与高光谱图像相关联，以确定图像中感兴趣的特定材料。这构成了该技术的基础及其主要优势：能够同时对不同的、异质的样品进行成像，并识别存在的材料。
HSI目前主要的应用领域包括：农业和食品安全领域，临床和科研检测，化学成像，矿物质检测，环境检测，天文学等多个领域。
Fig.5 用于可视化秀丽隐杆线虫细胞内的纳米粒子内化的CytoViva®应用实例。
AgNP被摄入并内化到秀丽隐杆线虫的细胞中。（a）秀丽隐杆线虫将CIT10 AgNP与食物一起摄取。（b）一些CIT10 AgNP也被吸收到线虫的细胞中，并转移给后代。通过HSI分析确认了AgNP的身份。
Prizmatix CombiLED光纤耦合LED光引擎使用二向色镜结合了多个高功率LED，并将输出耦合到光纤或光导中。其中一个重要应用领域就是高光谱显微镜（Hyperspectral-Microscopy imaging，HSI）。
该系统包括所有LED驱动器电子设备和主动散热模块。该产品的模块化设计可根据客户的特定要求进行定制，具有如下主要特点：
1. 单个19英寸机架式机箱中多达8个大功率LED
2. 提供大功率紫外线，可见光和近红外LED
3. LED波长和二向色镜组合器的选择都可以通过在线LED-Spectra-Viewer进行模拟配置，根据实验需要选择合适的波长组合
4. 多种控制模式可选：高精度电位器、模拟输入或使用电脑通过USB或RS232精确控制(12位DAC)
5. 每个LED通道均可单独通过TTL输入触发ON/OFF。
Fig.6 CombiLED光纤耦合LED引擎示意图
参考文献：
https://onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1002/wnan.1330
03光遗传学和斑马鱼
光遗传学方法是近十年来在神经科学领域迅猛发展的一项光控细胞新技术。该生物工程技术整合了光学、遗传学、计算机科学、基因工程、细胞生物学、电生理等众多学科。这项由多学科交叉应运而生的新型技术极大地推动了神经科学的发展，进而扩展到动物行为学、临床医学、分子生物学、细胞生物学等众多领域。在啮齿动物研究中，Prizmatix提供了完善的在体和离体解决方案：
Fig.7 Prizmatix在体（左）和离体（右）光遗传学解决方案
而在其他模式动物上，Prizmatix同样也提供了成套的解决方案。斑马鱼是目前生命科学研究中重要的模式脊椎动物之一。斑马鱼基因与人类基因的相似度达到87%，而且它们的身体是半透明的，可以很容易监测到神经活动，有“水中小白鼠”之称。由于斑马鱼幼鱼是透明的，在斑马鱼幼鱼中应用光遗传学刺激不需要光纤，只需要朝正确的方向发光，就可以轻松研究特定神经元在行为中的作用。
Noldus公司的DanioVision产品就用到了Prizmatix的LED光源组件，利用动物运动轨迹跟踪系统自动控制LED光源的触发时间和刺激强度，可以同时精确控制多达96个个体（使用96孔板）进行光遗传刺激。
Fig.8 Noldus公司的DanioVision产品
DanioVision的光遗传学组件是基于Prizmatix模块化LED光源系统。它由两种不同的LED波长组成，蓝光和黄光或两种颜色的组合，分别达到刺激或者抑制神经元活动的作用。
除了Noldus，另外包括MED以及DSI都采用了Prizmatix的LED光源产品作为其光遗传学的配置方案，在硬件上实现有效整合之外，软件上也实现对Prizmatix光源快速、精确的控制。
参考文献：
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S009286741930220X
https://www.cell.com/neuron/fulltext/S0896-6273(19)30010-8
04培养箱内的光刺激
我们偶尔会被问到的一个具有挑战性的应用是孵育器或者培养箱内的光照刺激。一般在这种炎热、潮湿和拥挤的条件下，很难提供高强度的光照。一位研究人员需要在微孔板大小的一个区域内照射强烈的蓝光，以激活光敏感通道蛋白。有很多原因没办法将超高功率LED光源直接放置在孵育器中，主要是担心透镜上的冷凝水会损坏LED，还有空间受限以及LED风扇的干扰等限制。
通过在孵育器外的超大功率LED上安装了一个液态光导器，经过一些微调，以平衡强度，使细胞不被强光破坏，LED成功地照亮了微孔板并激活了ChR2。
UHP-F产品系列的超高功率导光管耦合LED，是在孵育器或培养箱内提供强光的理想解决方案。UHP-F 有紫外光、可见光和白光三种类型，可通过3或5毫米液体光导器提供高达4瓦的强光。Prizmatix可提供定制的准直器，将光线引导到目标处，以达到每平方厘米的最大功率。
Fig. 9 UHP-F超高功率LED光源
参考文献：
https://www.cell.com/cell-reports/fulltext/S2211-1247(19)30167-6
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0896627320302233
05核磁共振波谱
核磁共振波谱法（NMR spectroscopy），又称核磁共振波谱，是将核磁共振现象应用于测定分子结构的一种谱学技术，LED光源在其中也可以发挥很大的作用。其中越来越受欢迎的一个应用是光纤耦合LED用于NMR光谱分析。选择适合NMR的光源，首先最重要的就是要做到核磁兼容，另外要提供足够的光强。其中最受欢迎的一个配置是Mic-LED光源、控制器、光纤耦合适配器和一根长的POF光纤。此配置可与各种波长的LED一起使用，最常用的波长配置是445和365nm。
光纤一端通过适配器链接LED光源，另一端的光纤包层需要去掉，以使光从侧面漏出。光纤被剪切在一个透明的塑料护套内，该护套插入到一个较大的管子里，里面有被分析的化合物，光纤组件置于磁场中进行检测分析。
这种设置的优点是，不同波长的LED可以用同一个控制器和光纤适配器来使用，需要其他波长只需要更换LED光源即可。
Fig.10 Prizmatix NMR套件
这个设置可以在下列两篇参考文献的 "Supporting Info"中看到。
另外，LED光源也可以和核磁成像等应用结合使用，我们团队有非常丰富的核磁环境下的配置经验，具体可以咨询我们以获得更多帮助。
参考文献：
“Discovery of a Photoinduced Dark Catalytic Cycle Using in Situ LED-NMR Spectroscopy”. September 2018
“Facile Quantum Yield Determination via NMR Actinometry” March 2018
06OptoBlocks模块化设计
Prizmatix模块化的LED可直接安装在显微镜的荧光端口上，也可以与光纤耦合器一起使用，也可与一个或多个LED组合成多波长光源。
Prizmatix Optiblocks是实现测光系统光学部分的理想方法。与笼式系统相比，刚性的Lego型模块已预先对准，节省了很多时间和麻烦。Prizmatix Optiblock模块易于配置和重新配置，包括光束组合器，光源，光纤耦合器等。使用标准的SM1螺纹，可以轻松安装滤光片和其他光学组件，并与其他供应商的零件集成在一起。
Fig.11 Prizmatix OptoBlocks示意图
目前提供的波长有：365nm、385nm、390nm、395nm、400nm、405nm、410nm、415nm、420nm、425nm、430nm、435nm、440nm、445nm、455nm、460nm、465nm、470nm、480nm、550nm、595nm、500nm、505nm、515nm、535nm、550nm、595nm、620nm、630nm和白光。
其他波长，包括红外和近红外，可根据要求提供。
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