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Piezo的结构解析之路
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编者按：2021年获诺贝尔生理或医学奖的piezo蛋白，曾由清华大学杨茂君教授及其课题组率先培养、解析。他们的这一探索性研究在相当程度上促进了piezo蛋白领域的其他研究，为帮助读者了解这项研究的难度和价值，本期我们邀请到清华大学生命科学学院的杨茂君教授介绍piezo蛋白结构解析的重要科研成果和创新突破。
2021年诺贝尔生理或医学奖由加州大学旧金山分校的David Julius，和Scripps研究所的Ardem Patapoutian两位学者共同获得，其主要获奖工作分别是发现了温度和触觉受体，相对应的蛋白家族分别为瞬时感应受体家族（Transient Receptor Potential，TRP）和机械敏感通道Piezo家族。
作为一名结构生物学家，我和我的课题组长期开展机械敏感通道相关研究，并解析了首个Piezo蛋白的三维结构。有幸收到“清华思客”的邀请，我向广大读者介绍Piezo结构解析的故事。
2021年两位科学家因为分别是发现了温度和触觉受体而获得诺贝尔生理或医学奖
1 Piezo课题前的技术积累
自2008年加入清华大学以来，我和我的团队一直以结构生物学为主要研究手段，结合生物化学和细胞与分子生物学，从事细胞感应外界信号以及细胞能量代谢相关蛋白质的结构与功能研究。在理论研究之外，团队还以这些生物大分子的高分辨结构为基础，开展药物设计及临床应用研究，取得了一系列重要研究成果。课题组在世界顶级期刊Nature、Science、Cell等杂志陆续发表多篇论文，同时获得了两项药物开发专利。
人类如何感知外界信号刺激是我们的重点研究方向之一，具体包括人类如何感受温度、痛觉和机械力刺激等等。我们的一项代表性工作是在腾冲嗜热菌中鉴定了一种阴离子选择性的机械敏感通道TtMscS，并且解析了其三维晶体结构，通过结构与电生理研究解释了其阴离子选择性的分子机理1。
经过几年的技术积累和学生培养，我们开始对探究真核生物的机械敏感通道发起挑战。当时，一些离子通道，例如TRP通道，钾离子通道和DEG/ENaC也被认为具有机械敏感性，然而这些通道的机械敏感性更像是他们的“附加属性” （在受到其它物理化学刺激激活的同时也具备一定的机械敏感性），并不能解释哺乳动物的很多机械敏感相关生理过程。
直到2010年Piezo蛋白功能的发现，以及2012年Piezo作为离子通道的鉴定，一类全新的哺乳动物机械敏感离子通道蛋白家族出现在大家的眼前——于是，攻克Piezo蛋白的结构就成为了那一时期我所在实验室的工作重点。
2 Piezo 蛋白前期的蛋白质晶体学尝试
在当时的条件下，真核生物膜蛋白的结构具有极高的研究难度。我们开始做Piezo课题的时候，蛋白质晶体学仍然是结构解析的最主要手段，并且世界上只有少数的几个课题组解析过真核膜蛋白的结构。该方向的主要难点在于高质量样品的表达纯化以及结晶过程。而Piezo的分子量特别大（单体含有超过2500个氨基酸），具有已知离子通道中最多的跨膜螺旋数量，同时由于其机械敏感特性，过量表达往往会对细胞产生毒性。这些特点对Piezo的表达量和晶体生长造成了很大的负面影响。
结构生物学研究同时需要巨大的脑力和体力付出。当时课题组的三年级博士生盖景鹏同学（现为上海科技大学常任教授，国家蛋白质科学研究上海设施双聘研究员）带领着我实验室的博士生李若翀同学，和刚刚入职清华大学药学院的肖百龙研究员课题组成员赵前程同学（现为耶鲁大学博士后），为这个课题的成功完成付出了巨大的努力。
盖景鹏博士带领两位新同学首先重点优化了Piezo蛋白在哺乳动物贴壁细胞中的表达与纯化条件的研究，修正了Ardem Patapoutian研究组得出的这个蛋白是一个四聚体的错误结论。为了拿到足够的piezo蛋白，他们需要每周培养数百盘细胞，全年节假日无休。更值得一提的是，盖景鹏博士当时自己开发了一套高通量的去污剂（影响膜蛋白性质的最重要因素之一）筛选方法，从200多种去污剂中找到了最适合稳定Piezo蛋白的三种，最终确定了该蛋白的表达、纯化条件。
培养表达Piezo蛋白用到的平板
经过复杂漫长的培养筛选过程，团队终于拿到了高质量的、可以满足晶体生长要求的蛋白，并且采取多种结晶手段获得了蛋白质晶体。尽管这些晶体并没有很好的衍射来进行结构解析，但是这些前期研究结果为我们后期使用单颗粒冷冻电镜技术来解析这一重要蛋白的结构，奠定了坚实的基础。
培养表达Piezo蛋白
3 Piezo的冷冻电镜结构研究
冷冻电镜技术经过数十年的发展，在硬件和软件上都取得了巨大的进步， 2013年底，美国加州大学旧金山分校的程亦凡和David Julius合作利用最新研发出来的直接电子计数照相机（K2相机）收集数据，并解析了首个TRPV1蛋白的高分辨率冷冻电镜结构。这一硬件技术的发展直接为冷冻电镜领域打入一剂强心针，并且引导了世界上诸多结构生物学研究组开始把冷冻电镜技术作为结构解析的重要手段。
在看到这一成果后，我们果断转身，充分学习并将冷冻电镜技术作为Piezo结构解析的研究手段。尽管当时我们只能获得很有限的冷冻电镜机，但通过与高宁课题组李婉秋博士（现为南方科技大学医学院助理教授、副研究员）合作，也得益于前期打下的良好生物样品基础，我们率先获得了Piezo蛋白中高分辨率的冷冻电镜三维结构，揭开了这一重要蛋白的神秘面纱2，让人们第一次在分子水平上看到了Piezo蛋白的样子。
Piezo蛋白中等分辨率结构
4 Piezo蛋白首个结构的重要意义
科学研究重要性的一个评判标准在于该研究对相关领域的促进性以及不可替代性，因此第一个发现往往具有最重要的推动作用。例如， David Julius 和Ardem Patapoutian的研究分别开启了各自的领域，不仅他们各自的课题组在后续研究工作中做出了出色的研究成果，同时也引起了全世界很多课题组的共同兴趣。相关领域内所有研究人员的共同努力使我们今天对感受温度的TRP家族和感受压力的Piezo家族蛋白从功能到结构上都有了较为深刻的认识，这些研究结果又促使他们获得了2021年的诺贝尔生理或医学奖。
我们团队对Piezo结构的首次解析，不仅在分子水平上揭示了Piezo蛋白独有的结构特点，为Piezo的功能研究提供了坚实的分子基础，也为之后的结构生物学领域在研究方法上指明了道路。
在我们2015年报道Piezo首个结构的三年后，肖百龙课题组、Ardem Papaoutian 课题组以及Roderick Mackinnon（2003年诺贝尔化学奖）课题组又分别报道了Piezo1蛋白更高分辨率的结构。其中，前两者使用了与我们完全相同的质粒和纯化方法，后者使用了我们筛选确定的去污剂。我们很高兴看到团队前期探索性的研究成果可以对其他研究起到促进作用，并且推动整个领域的前进。
5 Piezo课题培养的科研人员
通过对Piezo结构这一世界性难题的攻克，我们课题组培养了多位出色的科研人才。
其中，文章的第一作者盖景鹏同学于2015年博士毕业后加入美国Vollum研究所Eric Gouaux课题组继续进行机械力相关的课题研究，首次报道了听觉机械转导信号复合物组分PCDHL15-LHFPL5复合物的结构3，这也是目前为止已知的唯一的听觉信号转导复合物结构。此外，该课题组还首次报道了听觉信号放大过程起关键作用的电动蛋白Prestin的结构与工作机理4。盖景鹏博士于2021年11月加入上海科技大学生命科学与技术学院任常任教授，继续从事对感觉神经系统分子机理的深入研究。
文章的另一位共同第一作者李婉秋博士，于2017年博士毕业后加入南方科技大学Dinshaw J. Patel课题组从事表观遗传调控分子机制相关研究。该团队首次报道了组蛋白甲基转移酶NSD2、NSD3分别与核小体的复合物的高分辨率冷冻电镜结构，揭示了NSD家族蛋白特异性识别和甲基化组蛋白H3K36的分子机制，以及致癌突变蛋白增强NSD蛋白催化活性的分子机理，为针对NSD家族蛋白过量表达和突变等引起的多发性骨髓瘤、急性淋巴细胞白血病的靶向治疗研究奠定了分子基础。李婉秋博士在2020年加入南方科技大学医学院并建立自己独立的实验室。
参考文献：
1. Zhang, X. et al. Structure and molecular mechanism of an anion-selective mechanosensitive channel of small conductance. Proc Natl Acad Sci U S A 109, 18180-18185, doi:10.1073/pnas.1207977109 (2012).
2. Ge, J. et al. Architecture of the mammalian mechanosensitive Piezo1 channel. Nature 527, 64-69, doi:10.1038/nature15247 (2015).
3. Ge, J. et al. Structure of mouse protocadherin 15 of the stereocilia tip link in complex with LHFPL5. Elife 7, doi:10.7554/eLife.38770 (2018).
4. Ge, J. et al. Molecular mechanism of prestin electromotive signal amplification. Cell 184, 4669-4679 e4613, doi:10.1016/j.cell.2021.07.034 (2021).
作者简介
杨茂君
杨茂君，清华大学长聘教授，2008年加入清华大学生命科学学院。先后获得长江学者特聘教授，国家杰出青年基金，霍英东基础研究奖，树兰医学奖青年奖，北京市战略科技人才，谈家桢生命科学创新奖，茅以升北京青年科技奖，药明康德生命化学研究奖，万人计划科技创新领军人才，北京市科技奖基础类二等奖，吴阶平-保罗·杨森医学药学奖，国家中青年科技创新领军人才，国家重点研发计划首席科学家，教育部新世纪优秀人才支持计划，2016年度中国生命科学领域十大进展，《细胞》出版社2016中国年度论文奖等奖励和支持。
研究方向：主要以结构生物学结合细胞与分子生物学和生物化学为研究手段，从事细胞感应外界信号以及细胞能量代谢相关蛋白质的结构与功能研究，并以这些生物大分子的高分辨结构为基础开展药物设计及临床应用研究。
学术成就：先后发表SCI论文80余篇。自2008年加入清华大学以来，先后在《Nature》（2012；2015；2016）、《Cell》（2016；2017）和《Science》(2019) 等杂志发表通讯作者SCI论文50余篇。已获授权专利两项。首次报道了二型线粒体呼吸链复合物I的晶体结构，并对其功能、工作机制及药物研发进行了详细的研究；首次发现哺乳动物及人源线粒体呼吸链电子传递链超超级复合物和ATP合酶超超级复合物，并报道了它们的冷冻电镜高分辨率三维结构，为相关药物开发奠定了良好的基础。
供稿 | 杨茂君
约稿 | 张榕瑶
编辑 | 张榕瑶
排版 | 惠 珺
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