Tang R, Nancollas GH, Giocondi JL, Hoyer JR, Orme CA. Dual roles of brushite crystals in calcium oxalate crystallization provide physicochemical mechanisms underlying renal stone formation. Kidney Int. 2006 Jul;70(1):71-8. doi: 10.1038/sj.ki.5000424. Epub 2006 Apr 26. PMID: 16641926.
草酸钙结晶中透钙磷石晶体的双重作用提供了肾结石形成的物理化学机制
一水草酸钙(COM) 晶体是大多数肾结石的主要矿物质成分，因此在人类慢性疾病中具有重要作用。然而，导致草酸钙 (CaOx) 结石病的物理化学机制仅部分明确。由于CaOx的自发沉淀在肾脏条件下很少见，CaOx 结晶的替代途径似乎有必要解决这个中心问题。我们使用双常数组成法进行动力学研究，以同时分析 COM 和透钙石的结晶，即磷酸钙的形式。在典型的微酸性尿液环境中最容易形成。这些研究得到了扫描电子和原子力显微镜平行分析的支持。在这些研究中，矿化热力学稳定相 (COM) 的产生是由透钙磷石的存在引起的，透钙磷石是一种更容易沉淀的无机相。此外，一旦形成，COM晶体以透钙石晶体为代价生长，导致透钙石晶体溶解。这些研究表明透钙石可能在 COM 晶体的形成中起关键作用。因此，透钙磷石的这两种作用的定义为 COM 结晶的开始以及在大多数 CaOx 肾结石中检测到的磷酸钙的相对缺乏提供了物理化学解释。
肾结石（肾结石）的形成是一种常见的泌尿道疾病，通常会引起剧烈疼痛。1肾结石是与约 5% 的有机基质混合的无机结晶聚集体。尽管已经确定了几种晶体组合，但大多数结石由草酸钙(CaOx) 组成，主要是一水合物 (COM)；这些 COM 结石中也经常存在一小部分磷酸钙相。2. , 3. , 4.半数以上的CaOx 结石患者有高钙尿症。1. , 5.这种升高的钙水平提高了尿液中 CaOx 和磷酸钙的饱和度。
尿中 CaOx 和磷酸钙晶体的晶体成核、生长和聚集受到饱和度S的强烈影响。在大多数情况下，CaOx 不会在溶液变得过饱和 (S>1) 时立即沉淀。相反，溶液保持亚稳态，直到过饱和度超过临界值S c。尽管S>1 足以驱动 CaOx 的晶种生长，但体外研究表明 CaOx 的均匀成核是非常不可能的；6超过亚稳态上限以允许开始均相 CaOx 结晶所需的过饱和水平是很少见的，即使在正常人尿液中也曾达到过。7
除 CaOx 水合物外，大多数人的尿液中的结石形成矿物质通常是不饱和的。然而，尿 pH 值和流速的变化以及尿钙和/或磷酸盐排泄增加，例如，在摄入食物后可能导致磷酸钙浓缩产品一天数次变得过饱和。由于过饱和至少是暂时存在的，在许多CaOx 结石2.、 3.、 4 .中检测到痕量透钙磷石（DCPD、CaHPO 4·2H 2 O）和其他磷酸钙相可能反映了磷酸钙的重要作用在 CaOx 结石的发病机制中。8., 9.透钙磷矿不是热力学上最稳定的磷酸钙相。然而，它是在微酸性水溶液中最容易形成的相。9. , 10.它通常被认为是生物矿化组织（如骨骼和牙齿）中其他热力学更稳定的磷酸钙的前体。如上所述，复发性钙性肾结石患者的泌尿环境通常是过饱和的磷钙石。8. , 9. , 11. , 12.肾单位内，管状液中磷酸钙过饱和的最早部分是Henle环的下降细肢。13这有利于该段中透磷石晶体的沉淀。
基于这些考虑，CaOx 在透钙石晶体上的异质成核和生长是导致 CaOx 结石形成机制的一个合理的初始步骤。在本研究中，我们使用敏感的双常数成分 (DCC) 方法14. 15.严格检验了这一假设，该方法模拟了许多涉及多相的生物矿化过程中遇到的复杂条件。该方法允许同时监测透钙石和 COM 的成核和晶体生长和/或溶解。我们的扫描电子显微镜 (SEM) 和原子力显微镜增强了这一分析(AFM) 研究并行进行。结果明确表明透钙磷石晶体可以为COM微晶的异相成核提供位点并促进它们的聚集。随后，由于掺入 COM 导致钙离子减少而导致透钙磷石的溶解提供了额外的钙离子，这些钙离子增加了 CaOx 过饱和度，从而推动了额外的 COM 形成。
结果
DCC 研究解决方案的稳定性在初始研究中定义。在 pH 值 6.0 和 37° 下评估亚稳定反应溶液，相对于透钙磷石和 COM 都过饱和，分别含有 2.50、12.00 和 8.00 × 10 -2m M的钙、磷酸盐和草酸盐浓度，以及 0.15 M NaCl C。过饱和比，S，16钙镁石和 COM 分别为 1.271 和 1.864。在没有晶种的情况下，这些溶液对透钙磷石保持稳定至少 20 小时，对 COM 保持稳定至少 2 天而没有沉淀。在引入透钙石晶种后，立即触发添加用于监测透钙石生长的两种滴定剂溶液，而最初不需要添加 COM 滴定剂来保持成分的稳定性。因此，透钙磷石最初在添加的种子上生长，没有任何 COM 结晶。滴定剂体积随时间变化的曲线图（图 1) 表明透钙磷石生长速率（从这些曲线的斜率计算）在初始阶段随时间增加，因为总可用晶体表面积因生长而增加。仅在约 40 分钟的诱导期后才开始添加反映该阶段成核和生长的 COM 滴定剂（图 1）。一旦 COM 开始沉淀，钙磷石滴定剂的添加量就会显着减少，这表明在 COM 生长速度加快的同时，没有发生进一步的钙磷矿生长（图 1）。在将 COM 晶种添加到该混合系统中的对照实验中，只有 COM 的生长而没有任何透钙石的生长。
图 1。DCC 结晶曲线在磷酸钙(S透钙石=1.271) 和草酸盐(S COM =1.864)的混合溶液中。在左侧的播种部分，在 100 分钟时加入 20 mg 透钙磷石种子，该阶段的生长立即开始。再过 35-45 分钟后，COM 开始结晶。在成核研究中（不添加晶种），在 1400 分钟后首先观察到透钙石的形成，再过 100-120 分钟后开始 COM 的结晶。然而，在相同的实验条件下但在没有磷酸盐的情况下，这些 COM 过饱和溶液（S COM=1.864) 可以保持亚稳态超过 2 天而没有沉淀。因此，在这些实验中，透钙磷石诱导和促进了 COM 的成核。还值得注意的是，在这些研究中，在溶液中形成 COM 微晶后不久，钙磷石滴定剂的添加量急剧减少至零。这些现象是可重现的（> 8 次平行实验），并提供了强有力的证据表明在透钙石存在下促进了 COM 的形成。
由于在这些混合溶液中透钙石的过饱和度低于 COM，因此需要寻找透钙石而不是 COM 初始生长的热力学原理。对恒定成分 (CC) 生长速率数据进行分析以确定界面能 ( γ SL)17表明，钙磷铁矿生长是优选的，因为它的计算界面能相对较低，为 4 mJ m-2，而 COM 为 13.1 mJ m-2。
在没有草酸盐的情况下，在S透钙石=1.271 的对照非晶种透钙石成核实验中，诱导期τ为 ~1 天，小于 COM 诱导期τ的一半 > 2 天，S COM=1.864 .
混合过饱和溶液中的非晶种成核反应也通过 DCC 监测（图 1）。在所有情况下，首先在 1400 分钟（23.3 小时）时观察到透钙石沉淀，这与没有草酸盐的对照实验的结果一致。再过 120 分钟后才开始添加 COM 滴定剂（图 1）。一旦 COM 开始沉淀，钙磷石滴定剂的添加量就显着减少，这表明在 COM 生长速度加快的同时，没有发生进一步的钙磷石生长。
在这些反应过程中，过滤的固相周期性地从浆料中抽出，并通过扫描电子显微镜、能量色散光谱和 X 射线衍射进行检查，证实在图 1的阶段 NI 中第一个形成的沉淀物是纯透钙磷石。在第二个延迟期之后，COM 开始在现有的透钙石表面沉淀。在此期间，收集的固体中的 COM 微晶数量增加（图 2和3）。
图 2。DCC 成核实验期间沉淀剂的 SEM 和能量色散光谱结果。(a–c ) 分别代表图 1中的 NI、N-II 和 N-III 阶段。在 NI 阶段仅看到透钙石微晶，在 N-II 的透钙石表面上形成COM微晶。在N-III，能量色散光谱表明骨料表面没有透钙磷石，但研磨后X射线衍射可以发现透钙磷石，表明它存在于芯中。N-IV 的固体形态与 N-III 相似；然而，即使在研磨后，X 射线衍射也没有检测到透钙石峰（参见图 3）。
图 3。DCC 成核研究中不同阶段沉淀相的 X 射线衍射，表明透钙石在诱导 COM 生长后溶解。
一个值得注意的出乎意料的实验结果是，在 N-IV 阶段（图 1），先前形成的透钙石微晶从沉淀的固体中消失，转化为纯 COM。因此，尽管系统相对于透钙石和 COM 都保持过饱和，但透钙石经历了溶解。
离子形态分析（表 1）表明离子浓度在 COM 形成之前得到了很好的维持。在 N-II-N-IV 阶段，磷酸盐浓度逐渐增加，而钙和草酸盐几乎保持不变。磷酸盐离子浓度（~4%）的上升是显着的，因为 DCC 旨在将组成保持在 ±2% 以内。磷酸盐增加的成因最好通过透钙石微晶溶解过程中的释放来解释。根据来自非晶种成核实验的滴定剂添加数据，估计沉淀的透钙磷石微晶的完全溶解将使最终（N-IV阶段）溶液中的磷酸盐浓度增加约4.0×10 -4 M. 这与表 1中的化学分析数据非常吻合。在透钙石晶种生长研究中，由于最初引入了 20 mg 透钙石晶种，磷酸盐浓度的最终增加更为明显（~10%，表 1），估计值也与实验数据一致。SG-II 阶段固相的 SEM（图 4) 显示在溶解的透钙石边缘形成 COM：生长过程中典型的光滑透钙石表面在溶解后变得粗糙。在 SG-II 阶段，透钙磷石的总量始终为 27±3 mg，而在 SG-I 阶段，COM 成核之前透钙磷石的总质量达到~40 mg。显然，13 mg 透钙磷石的损失只能通过其在溶液中的消耗来解释。此外，原位原子力显微镜研究还证实了在 COM 形成时透钙石的溶解（图 4b-e）。AFM 研究表明 (i) 在将透钙磷石微晶浸入反应溶液后，当溶液过饱和时，该相开始生长；(ii) 透钙磷石溶解坑是在高草酸盐浓度的情况下形成的，此时透磷石不饱和（图 4c）；(iii) 透钙磷矿继续溶解，凹坑随着表面粗糙化而变大（图 4d）；(iv) COM 在溶解的透钙磷石表面附近的溶液中形成（图 4b 和 e）。这强烈表明透钙磷石在诱导该相的成核后溶解以提供用于 COM 结晶的钙离子。还应该注意的是，在 AFM 研究中，COM 在透钙石上的诱导时间段与 DCC 批量实验结果一致。
表 1。DCC 实验期间过滤固体和反应溶液的化学分析
|
空单元格 |
P:Ca 比 |
溶液/m M | ||
|---|---|---|---|---|
|
阶段 |
固体 |
钙 |
磷 |
Ox |
|
N-I |
1.00±0.02 |
2.50±0.02 |
12.00±0.01 |
0.080±0.001 |
|
N-II |
0.67±0.05 |
2.50±0.03 |
12.10±0.01 |
0.080±0.001 |
|
N-III |
0.16±0.03 |
2.49±0.03 |
12.30±0.02 |
0.080±0.001 |
|
N-IV |
～0.0 |
2.48±0.04 |
12.40±0.01 |
0.079±0.001 |
|
SG-II |
0.72±0.02 |
2.50±0.03 |
12.20±0.01 |
0.080±0.001 |
|
SG-III |
～0.0 |
2.49±0.03 |
13.20±0.02 |
0.078±0.002 |
缩写：Ca，钙；DCC，双常数组成；牛，草酸盐；P，磷酸盐。
图 4。SEM 和AFM图像显示在溶解透钙石表面附近形成了 COM。( a) SG-II 阶段的 SEM 显示许多小的 COM 微晶在溶解和粗糙的透钙磷石表面上沉淀（箭头）。(b-d) AFM 偏转图像 (20 × 20μ m)。这些图像显示了草酸盐对透钙磷石 (010) 生长的影响。(b) 在含有 0.6 m M Ca2 和 60 m M PO4 4-的溶液中生长的透钙石表面。三角形生长小丘代表正常的透钙石生长。(c和d)在含有 0.6 m M Ca2 、60 m M PO4 4-和 1.1 m M C2O4 2-的溶液中，面积与 (b) 相同。在这种草酸盐浓度下，透钙石已变得不饱和。(c) 在透钙磷石表面形成溶蚀坑（箭头），同时在溶液相中形成 COM 颗粒。灌注液中的 COM 颗粒在流动过程中显示为条纹。(d) 在光滑透钙磷石表面上溶解坑（箭头）发展的低倍显微照片。(e) SEM 显示在实验结束时停止灌注后沉淀在透钙磷石表面上的 COM 颗粒。
由于临床观察表明尿酸水平升高和柠檬酸盐缺乏可能促进肾结石形成，18 . 19.通过体外DCC 成核研究评估了这些尿液成分的潜在作用（图 5）。所得 DCC 结晶曲线具有与图 1中相似的特征。然而，在 0.05 m 尿酸的存在下，透钙磷石和 COM 的结晶都得到了促进，并且它们的成核事件之间的时间间隔减少到 30 分钟。SEM 显示，在没有尿酸的反应溶液中，在透钙磷石晶体上成核的 COM 微晶保持分离（图 6a），而在尿酸存在下形成的 COM 晶体显示出广泛的晶体聚集（图 6b）。相反，0.05 m M柠檬酸盐抑制透钙石和 COM 的成核（图 5）。通过 0.05 m M柠檬酸盐将透钙石成核的诱导期延长至 2900 分钟，这个间隔几乎是没有添加剂的对照研究的两倍。柠檬酸盐还延缓了 COM 在透钙磷石表面上的成核；延迟时间增加到 200-240 分钟。
图 5。在尿酸和柠檬酸存在下的 DCC 成核和结晶图显示出与图 1和图2中相似的特征。然而，0.05 m尿酸促进透钙磷石和 COM 的形成。这将磷灰石成核的诱导时间从~13 490 减少到~860 分钟，并将这些相的成核之间的时间段减少到约30 分钟。相比之下，5.0 × 10-5 M柠檬酸抑制透钙磷石的成核，将诱导期延长至约 2900 分钟，几乎是没有这种添加剂时的两倍，透钙磷石和 COM 形成之间的延迟期为约 220 分钟.
图 6。( a ) 在没有透钙磷石的情况下，生长的 COM 微晶分离良好，没有肾结石中所见的聚集。(b ) 然而，在存在尿酸的情况下由透钙磷石诱导的 COM 沉淀会产生与在肾道中观察到的相似的广泛聚集的团块。(c) 这些COM聚集体在一定程度上被柠檬酸盐分散，这也阻碍了COM的晶体生长。
讨论
目前的研究清楚地表明，透钙磷石晶体在不会导致自发沉淀的 COM 过饱和水平下作为 COM 异质成核的非常有效的基质。他们进一步证明，一旦在这些条件下形成，COM 晶体会导致透钙石晶体的溶解。
在目前的研究中，尽管 COM 的过饱和度高于透钙石，但最初的成核微晶是透钙石，而不是 COM。在没有草酸盐的情况下，在S透钙石=1.271 的透钙石成核实验具有约 1 天的诱导期，小于超过 2 天的一半，对于S COM = 1.864 的 COM。透钙石和 COM 的这些过饱和度肯定低于肾单位更远端部分的泌尿环境中普遍存在的过饱和度。然而，我们目前的研究使用纯溶液和过饱和度进行了优化以维持 CC，以便最容易确定 COM 结晶和透钙磷石之间的关系。作为蛋白质抑制剂不存在尿液中的结晶，我们的研究可以在比尿液中存在的过饱和度更低的水平下进行。应该注意的是，蛋白质抑制剂对磷酸钙底物上 COM 的成核（和生长）影响的研究结果将是显而易见的。
经典结晶理论在溶液中晶体形成过程中的固-液界面能量控制方面已经令人满意地解释了均匀成核的临界过饱和要求的存在。因此，在驱动力（过饱和度）足够大之前，结晶不是自发的。相反，在新产生的晶体在过饱和溶液中持续存在之前，达到了亚稳态并且经过一段时间，即诱导期τ 。τ是一个复数，但可以根据简化的成核理论20. , 21 来估计。(1)lnτ∝[C1 C2γSL3ķ3吨3(ln小号)2]
在方程(1)中，C 1和C 2是独立常数，k是玻尔兹曼常数，γ SL是界面能。异质结晶，包括一个结晶相在另一个结晶相上的外延过度生长，可以降低临界过饱和度，从而降低τ。这种机制被认为在对生物体功能至关重要的细胞外结构的生物矿化中发挥重要作用，例如海洋生物的壳、骨骼和牙齿，以及在泌尿系结石的病理形成中。22因此，可以通过经典结晶理论解释较短的透钙石成核诱导期，因为其相对较低的界面能（方程（1）中的γ SL）为 4 mJ/m2，而 COM为 13.1 mJ/m2。.17
在对于两种微溶盐中的每一种都过饱和的溶液中，如果盐具有至少一个共同离子，则具有较高溶解度的相将转变为第二相。在目前的体外实验中，透钙磷石（K sp=2.36 × 10-5 M2 ）比COM（ K sp=2.47 × 10-9 M2）具有更高的溶解度，因此草酸盐在与磷酸盐的钙竞争中胜出。如图7 所示. 当溶液中存在 COM 晶体时，大多数钙离子优先与草酸盐结合形成 COM。先前CC研究的结果表明，在相同的过饱和度下，COM的生长速率明显高于透钙钙石（~4 × 10-4mol m-2min-1与~5 × 10-5mol m-2相比）最小-1)。15. , 23.因此，COM 很容易在溶解的透钙磷石表面上形成（图 4）。由于 COM 在水溶液中的溶解度要低得多，这就解释了为什么在上述实验中晶种为 COM 时不会发生透钙石生长。此外，COM 成核后，DCC 实验中透钙磷石滴定剂的添加大大延迟，最终将停止，正如实验所观察到的那样。
图 7。示意图显示了基于钙离子优先与草酸盐缔合形成 COM 和磷酸盐从透钙石中释放的动态过程。
由于局部钙浓度高，透钙石表面是形成 COM 的良好基质（图 2b）。然后这些 COM 微晶有可能聚集形成结核，最终可能演变成肾结石。然而，在对照实验中，使用 COM 作为晶种或在混合过饱和溶液中的成核过程中，COM 微晶保持分离（图 6a）。在体内，这表明，如图 6b 所示，透钙磷石位于 COM 晶体的核心，这是肾结石中经常遇到的位置。2. 3.随着时间的推移，所有透钙磷石都可能转化为 COM（图 1的 N-IV 阶段）。
在许多 CaOx 肾结石中，有一个相对突然的层与层组成变化，涉及矿物相以及有机成分，其中可能包括尿酸。18. , 24.在存在尿酸和柠檬酸的情况下观察到的沉淀顺序可能会阐明早期肾结石形成和预防的概念。值得注意的是，在存在尿酸的情况下形成的“体外”结核类似于肾道中形成的结石。相比之下，柠檬酸盐延缓了透钙磷石和 COM 的沉淀，也减少了所得 COM 的聚集（图 6c）。这些观察结果与最近的观察结果一致，即柠檬酸盐增加透钙磷石的亚稳定性上限，即直接和通过增加 pH 值发生自发沉淀的点。25柠檬酸盐还直接抑制 COM 晶体的生长。26
考虑与 Randall 斑块研究相关的当前研究可能会进一步阐明导致 CaOx 结石形成的事件序列。这些斑块是乳头尖端处或附近的间质磷酸钙晶体沉积部位。最近有报道称，兰德尔斑块的最初形成部位位于Henle 薄环的基底膜中。27这一发现特别值得注意，因为这是肾单位内磷酸钙过饱和的最早部位，13并且在微酸性条件下有利于透钙石的形成。此外，胶原蛋白，如基底膜中的胶原蛋白，已被证明可以从尿液中沉淀透钙磷石。28由于透钙磷石的热力学稳定性不如羟基磷灰石，因此随着时间的推移转化为羟基磷灰石可能是检测羟基磷灰石的基础，而不是兰德尔斑块中的透磷石。27Randall 斑块在 CaOx 结石病的发生中起重要作用的假设与 CaOx 结石形成的数量与斑块覆盖的乳头状表面数量相关的观察结果一致。29这一假设也与我们之前的观察结果一致，即 COM 是由磷灰石成核的。16这些附着在肾脏内的磷酸钙晶体不仅为 CaOx 晶体的成核提供了场所，而且还提供了一种附着物，使它们能够增大到将保留在泌尿系统内的大小。
结论
目前的研究合理化了透钙石在 CaOx 结石形成中的核心作用，并提出了柠檬酸盐和尿酸可能影响这一发病顺序的机制。在控制良好的实验条件下获得的 DCC 数据为更好地理解磷酸钙相在导致肾结石形成的物理化学机制中的作用提供了基础。DCC 方法的使用使我们能够明确地表明矿化热力学稳定相 (COM) 可以由另一个更容易沉淀的无机相 (刷石) 诱导。此外，一旦形成，COM 晶体以透钙磷石晶体为代价生长，导致它们的溶解，从而为大多数肾结石中检测到的 CaOx 与磷酸钙的相对比率提供了物理化学基础。
材料和方法
DCC
(CC) 方法可以模拟体内生物稳定的结晶环境。在实验过程中添加14种滴定剂溶液以保持恒定的反应溶液浓度，并且可以根据滴定剂添加速率计算生长动力学。电位计用于控制从步进电机驱动的滴定管添加滴定剂。反应引发以电位计触发滴定溶液的添加，其浓度基于使用质量平衡和电中性表达式以及扩展的德拜-休克尔方程的物种形成计算来计算。
在自然界中，晶体悬浮液中同时发生的过程并不罕见。DCC 方法（包含两个不同离子选择性传感器的两个 CC 设备）用于在恒定驱动力下同时控制两个结晶过程。16在这种情况下，分别用 BA 和 BC 代表 COM 和透钙石，它们共享一个共同的 B 离子（钙）。对于 BA 和 BC 晶体的同时生长，B 离子（钙离子特异性电极（Orion 93-20））和 C 离子（pH 电极（Orion 91-01），如 HPO4 2- H → H2PO4 -) 选择性电极分别用于控制 BA 和 BC 滴定剂。BA 和 BC 的反应速率可以从相应记录的滴定曲线中计算出来。在某些条件下，随着两个相（BA 和 BC）的增长，浓度 [X] [其中X=B、A 或 C] 从设定点值 [X]s 的变化将记录一个电位差，ΔE, 在由电极感应的电位器上。当 ΔE的大小超过电极响应阈值 ΔE 0时，将触发添加滴定剂以补偿浓度变化。相对浓度变化，ε, 可以写成(2)ε=[X]-[X]s[X]s=经验(zFΔ乙0R吨)-1其中z是电极感应到的离子电荷，R、T和F分别是气体常数、绝对温度和法拉第常数。因此，ε的值取决于受控离子的化合价和电位响应阈值。DCC反应的速率可以使用下述方法计算。在加入 BA 滴定剂之前经过的时间 dt 1由下式给出(3)d吨1=ε乙[乙]s五R文学学士 R公元前其中，V是反应溶液的体积，R BA和R BC分别是 BA 和 BC 相的总反应速率。可以看出，dt 1是物质[B]由于晶体生长而达到设定值[B]s所需的时间。将 [ B] 恢复到其原始值 [B]s所需的添加的 BA 滴定剂体积 dV 1（dV是单个滴定剂滴定管的体积）由下式给出(4)d五1=ε乙[乙]s五CeBA其中C eBA是有效的 BA 滴定剂浓度。在 d t 2时间间隔后，[C] 的变化足以触发添加 BC 滴定剂，根据(5)d吨2=εC[C]s五R公元前添加的 BC 滴定剂体积 dV 2由下式给出(6)d五2=εC[C]s五C电子商务其中C eBC是有效的 BC 滴定剂浓度。由于 [C] 的变化仅由 BC 相的生长产生，因此 BC 滴定剂的添加将由 C 传感器控制，就好像只有该相在系统中发生反应一样。根据等式 (5)和(6)，然后可以使用以下公式确定 BC 晶体的速率(7)R公元前=C电子商务d五2d吨2
在时间间隔 d t 2中，将有εCdt 2 /εBdt 1加入 BA 滴定剂的脉冲，具体取决于电极灵敏度。然而，由BC相引起的[ B]的部分消耗已经通过在d t2中添加BAC滴定剂得到补偿，这将减少BA滴定剂的添加量。因此，在时间段 dt 2中所需的 BA 滴定剂的总体积 dV BA将由下式给出(8)d五文学学士=d五1εCd吨2ε乙d吨1d五2C电子商务CeBA
重新排列方程（8）并引入方程（3）和（4），我们得到(9)ε乙CeBAd五文学学士d吨2=εCCeBAd五1d吨1-ε乙C电子商务d五2d吨2=εCR文学学士 εCR公元前-ε乙R公元前
在等式 (9)中，d V BA/dt 2是 BA 滴定剂体积-时间图的总斜率。因此，如果ε B =ε C，则可以从相应的记录曲线计算 BA 和 BC 的反应速率，在同步晶体生长期间由计算机精确保持，并且可以计算 BA 和 BC 相的单独 DCC 曲线。
I. COM (BA) 相位/由钙电极控制：滴定管编号：1{吨氯化钙2=2W氯化钙2 C效果,通讯吨氯化钠=2W氯化钠-2C效果,通讯滴定管编号：2{吨ķ2牛=2Wķ2牛 C效果,通讯吨氢氧化钾=2W氢氧化钾和吨KH2采购订单4=2WKH2采购订单4
二、透辉石 (BC) 相/由玻璃电极控制：滴定管编号：1{吨氯化钙2=2W氯化钙2 C效果,磷灰石吨氯化钠=2W氯化钠-2C效果,磷灰石滴定管编号：2{吨KH2采购订单4=2WKH2采购订单4 C效果,磷灰石吨氢氧化钾=2W氢氧化钾 2C效果,磷灰石和吨KH2牛=2Wķ2牛其中W和T分别是反应溶液和滴定剂中的总浓度，C eff、COM和C eff，透钙磷石分别是相对于 COM 和透钙磷石的有效滴定剂浓度。
原位原子力显微镜
使用带有 Nano III 控制器 (Vecco) 的多模式 AFM 以接触模式收集图像。所有图像都是在高度和偏转模式下使用尽可能低的尖端力获得的，以减少尖端 - 表面的相互作用。透钙磷石晶种固定在流体池内，并且在拍摄图像时使过饱和溶液（与 DCC 反应溶液相同）通过它。
扫描电子显微镜
在真空下，固体样品被溅射镀上一层薄的碳沉积物以提供导电性，然后使用场发射 SEM (Hitachi S-4000) 进行检查，通常为 20 或 30 KeV。
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