经典的转膜方法是电转移，因为电转移需要配套垂直电泳槽来进行。如何做这个“海绵—几层滤纸—胶—膜—几层滤纸—海绵”的“三文治夹心”，在分子克隆上已经有详细的介绍，相信大家都很容易找到。
中洪转膜操作实拍图
一些细节：
全程手套操作
一则避免手印污染影响结果；
二则保护自己(未交联的丙烯酰胺、甲醛等等虽不立即致命但都会慢慢毒害你的身体，可不要这样白白为科学献身哈)
如果WB前没有可参考的资料——比如不知道是否有表达，比如抗体少还要摸条件(稀释度)，可以用剪膜剩下的边角料来先做几组点杂交摸条件，省点时间省点试剂；
去掉积层胶后，预染的marker可用以识别胶上下方向和膜的正反面(预染Marker如果照着说明书用量，有可能在电泳时看不到条带，但转膜时有浓缩效应而且背景白就可以看到了。如果要电泳能看到就要参考电泳的那个用量，或者多加1—2倍的量);如果目标蛋白小，指示剂也可以指示方向，但是如果蛋白大，指示剂已经跑出去了，就要留意分清胶上下方向，切个小角是常用的方法。
膜上要做好标记，识别正反面和上下。剪一个小小角最方便。膜和滤纸一起裁最好(不过滤纸上下叠多了膜不好剪，硝纤膜容易裂，用利刀 尺子 垫厚报纸划比较容易)尽量和胶一样大小，胶用纯水冲洗一下后用电泳缓冲液平衡过再量。我自己通常剪的时候会故意长宽各比胶少1mm，保证膜和胶不会碰到对方背后的滤纸就好。
“三明治”做好以后，接下来的事情就简单多了。把“三明治”锁朝上插入E槽，方向是“黑对黑”、“白对红”，荟荟解释一下什么叫“黑对黑”、“白对红”：上面我们说了蛋白要从D夹的“黑”面转向“白”面，所以D夹的“黑”面要对着电场的负极，“白”面对着正极。E槽内面如图所示的方向分别有一排导电铂金丝，E槽“黑”面的铂金丝连着电源的负极，而“红”面的铂金丝连的是正极。所以“三明治”放入E槽的方向一定要将D夹的“黑”面对着E槽的“黑”面，D夹的“白”面对着E槽的“红”面，以防蛋白转反方向。E槽里面可以放下两块“三明治”，所以可以同时转两块膜。放好“三明治”，把E槽装进电泳槽，任意装，没方向区别。按说后面倒上缓冲液、接上电源就可以开始转了，但是！转膜过程中由于产热较多，我们必须给系统降降温（这也是为什么缓冲液要预冷的原因），所以小伙伴们习惯上把电泳槽埋到冰里。荟荟一般是找个脸盆，或者一个冰盒（冰盒的效果好一点且省冰，不用太大，比电泳槽大一两圈就行），先在底层铺一层冰，然后放上电泳槽，接着把冰盒与电泳槽之间填满冰块儿，然后把缓冲液倒进电泳槽，但是先别全倒，因为我们还有一个降温神器没用上呢，那就是第一张图里的F白色盒。E槽放进电泳槽以后有一边会留点空，这个空就是用来装F盒的，但是F盒用之前得先放上一个小冰袋冷冻起来，这才能降温。好了，把预先准备的F盒也放进电泳槽，把缓冲液倒满电泳槽，然后把电泳槽的盖子盖上（注意对准盖子和E槽电极的颜色），最后用冰把整个电泳槽全封住（露个盖子也行，没那么夸张的），接通电源调节电流，注意是电流！电流！不是电压！调节时间，开始转膜。
跟电泳一样，等待转膜的过程童鞋们可以该干嘛干嘛，而且因为是定时的，所以童鞋们到点收货就行，不用一直盯着，盯也盯不着，全被盖住了。不过呢，时不时还是要看一眼，万一系统出现错误呢。荟荟就遇到过一次系统错误，当然荟荟当时同时转了四张膜，用了两套转膜系统，嘻嘻，一般是不会出错的。转膜完成以后系统会有提示，童鞋们断开电、刨开冰，把“三明治”掏出来解锁，然后打开D夹把膜取出来就行了。这时候胶变成透明的，而膜上多了一排marker。如果童鞋们不放心蛋白有没有转上去，可以有两种办法检验：一是把转完的胶做个考马斯亮蓝染色，看还有没有蛋白在胶上；二是把转完的膜做个丽春红染色，看膜上有没有蛋白。但是一般是不会有问题的。转完膜，荟荟喜欢把膜修剪一下，因为准备膜的时候大家都会剪得比较大，怕不够，但是越大的膜孵育抗体的时候用的抗体的量就越多，所以荟荟喜欢尽量把膜修小一点。这时候NC膜就又体现了优势，转完的NC膜由于长时间被挤压会形成跟胶一样的形状，所以荟荟只要沿着形状的边缘修剪就好了，但是PVDF膜由于韧性好，挤不出来形状，所以修的时候就比较桑脑筋，这也是荟荟喜欢NC膜的原因，之二。这里荟荟要提醒童鞋们，如果童鞋们也选择修剪膜的话，剪完以后一定记得把原先在膜上剪的标记再做一遍。到这里为止，转膜就说完啦。
转膜后的封闭注意：
转膜后，膜上其他的空白位置需要用封闭液封闭。
Western的灵敏度某种程度上受限于封闭做的好不好。脱脂奶是最常用的经济配方(实验太晚了还可以补充一下营养，哈哈)，用这种封闭剂由于里面可能有痕量的生物素和碱性磷酸酶，可能造成背景污染而不适合生物素—亲和素的检测方法(如果用了生物素标记的Marker而且结果背景较高，分析结果也有可能是受此影响)，脱脂奶也不适合碱性磷酸酶检测(AP)方法。如果采用碱性磷酸酶检测系统，封闭剂最好用6%酪蛋白 1%聚乙烯吡咯烷酮 10mmol/L EDTA磷酸缓冲盐加热65度1小时确保碱性磷酸酶失活(可以加0.05%叠氮化钠，新鲜最好)。经济的脱脂奶配方和AP兼容得不太好，再加上HRP的底物选择范围也更宽，现在HRP是越来越普遍的选择。但是叠氮钠(NaN3)对辣根过氮化物酶(HRP)有灭活作用，如果用HRP检测系统则封闭液不要加叠氮化钠为好。切记。封闭时间和封闭剂的量都要足够。封闭不完全，后面就全白忙活了。
如果选用AP作为显色方法，封闭时就要选择Tris缓冲体系，不要用PBS，因为PBS干扰AP。
注意事项：
1. 凝胶靠近负极，膜靠近正极，两边的滤纸不要接触到，防止短路；
2. 制作“三明治”过程中，戴手套并用镊子夹住膜的边缘，避免手上的蛋白或油脂降低转膜效率；
3. 凝胶和膜以及滤纸之间不要有气泡，会导致转膜不完全；
4. 整个“三明治”的制作过程都在转膜液中进行；
5. 转摸过程会有非常严重的放热现象，因此最好在冰浴或冰室中进行。
