研究背景
AD是最常见的与年龄相关的神经退行性疾病。主要病理特征包括Aβ错误折叠形成的淀粉样斑块，tau异常磷酸化引起的神经原纤维缠结，以及局部神经炎症反应。虽然以神经元为中心AD研究已有几十年，但过去的二十年研究也强调了非神经元细胞命运及其在疾病进展的潜在贡献。单细胞RNA测序（scRNA-seq）技术陆续发现与该疾病相关的新致病途径和细胞类型（主要在小胶质细胞和星形胶质细胞中），进一步促进该领域的进展。少突胶质细胞是中枢神经系统（CNS）髓鞘形成的细胞，约占大脑中细胞数量的20%。在AD和痴呆的背景下，在死亡患者的大脑和小鼠模型中均观察到大量髓鞘改变和破坏。然而，尽管少突胶质细胞在大脑中作用重要，但尚不清楚它们的命运是否参与以及在AD中发生何种改变，它是否是病因学依赖性的，或者是跨病理学保守的。使用大规模单细胞RNA测序（MARS-seq），作者发现5xFAD小鼠模型中出现一种少突胶质细胞状态，称之为DOLs。通过对已发表的数据集重新分析，发现在不同的痴呆相关病理模型和自身免疫性神经炎症中存在相似的细胞状态，表明这种状态在多种疾病中出现。免疫组化和空间转录组学发现在5xFAD脑中富含Aβ斑块的区域发现了DOL样细胞。在AD患者的死后颞叶皮质中也发现了DOL样细胞，但在非痴呆对照组中未发现。总的来说，该研究揭示了少突胶质细胞对不同中枢神经系统病变的反应，与疾病病因无关。
结果
1. 5xFAD小鼠模型中，少突胶质细胞主要转录组学改变
少突胶质细胞通常被视为被动的旁观细胞，对外部环境的反应有限。作者推测：与其它更具活力的非神经元细胞相比，在AD相关的条件下，少突胶质细胞是否发生改变？对野生型（WT）和5xFAD小鼠（6-8个月：n=4 5xFAD，4 WT；10-11个月：n=3 5xFAD，4 WT；15个月：m=2 5xFAD，1 WT）（一种淀粉样变的小鼠模型，携带5个家族性AD突变，具有Aβ斑块的病理进展）全脑中分离出的非免疫、非神经元（CD45−) 细胞进行单细胞测序。对10690个细胞进行严格比对分析发现：WT和5xFAD小鼠之间未观察到细胞库质量的显著差异。使用Pagoda2 pipeline（单细胞降维聚类分群工具）对细胞进行聚类分析，并筛选出17细胞群（图1a、b）。鉴定的主要群体为成熟髓鞘少突胶质细胞（Plp1、Mbp和Mog）、星形胶质细胞（Slc1a2和Slc1a3）、周细胞（Myl9、Vtn和Rgs5）、内皮细胞（Ly6a和Ly6e）、室管膜细胞（Tmem212和Ccdc153）和脉络丛上皮细胞（Ttr和Enpp2），以及其它稀有群体（嗅鞘细胞、成纤维细胞和GABA 神经元）。还检测到小胶质细胞（Hexb和Cx3cr1）和红细胞（Hbb-bs和Hbb-bt）。总的来说，相对于WT，5xFAD中的细胞类型组成和丰度没有改变。接下来，作者对源自5xFAD或WT大脑的细胞进行差异基因表达分析，以确定每个细胞群受疾病影响的程度。为了精确量化差异表达基因（DEG）的数量，作者使用了二项回归的方法，发现成熟的髓鞘少突胶质细胞是变化最大的群体，具有98个差异基因，只有25%的基因也被其它细胞群体共享（图1c，d）。为了排除取样偏差的影响，作者进行了效能分析，发现即使采样1700个少突胶质细胞（其原始数量的一半），差异基因的数量仍高于其他细胞类型（图1e）。总之，这些结果表明在5xFAD小鼠中少突胶质细胞显示出广泛的转录改变。
Fig.1 少突胶质细胞在5xFAD小鼠模型中显示的主要转录组学改变
2. 一种疾病相关少突胶质细胞状态的鉴定
受到5xFAD小鼠中成熟髓鞘少突胶质细胞中观察到的转录变化的启发，作者接下来对5xFAD与WT进行了更深入的分子表征分析。为了对成熟少突胶质细胞进行特异性富集，对半乳糖神经酰胺酶阳性（GalC ）细胞进行了分类（图2a）。作者从6-24个月的不同月龄的5xFAD小鼠中分选细胞，并使用年龄匹配的WT小鼠作为对照。将测序的细胞过滤并与先前测序的少突胶质细胞合并计算，形成一个包含13572个高质量细胞的数据库（6-8个月：n=4 5xFAD，4 WT；10-11个月：n=6 5xFAD，5 WT；15个月：m=3 5xFAD，3 WT；24个月：m=4 5xFAD，4 WT）。这些少突胶质细胞的精细聚类分析显示了14个不同的亚群，每个亚群都具有独特的表达谱（图2b，c）。作者进一步分析，是否有少突胶质细胞簇在5xFAD鼠比WT鼠中表达更丰富。该分析显示簇12和簇14相对于WT更多富集于5xFAD脑中（图2d）。以Ccl4和Lyz2表达为特征的簇14（图2b）仅起源于24个月大的5xFAD小鼠，占少突胶质细胞的9%至30%。相反，在6-8个月及以后的所有测试时间点都发现了簇12。该簇在5xFAD小鼠中占所有少突胶质细胞的5%至15%，具体取决于年龄，但在WT小鼠中不超过5%（图2e）。该簇也与UMAP中的其余少突胶质细胞明显分离（图2c）。由于其随疾病进展显著增加，将这种转录状态称为“疾病相关少突胶质细胞”（DOLs）。有趣的是，在9-10个月大AD小鼠模型中，在脑内淀粉样斑块和炎症出现很久之后，检测到了DOLs。相反，在该小鼠模型中，疾病相关小胶质细胞（DAM）最早出现在出生后1-2个月，显示小胶质细胞和少突胶质细胞之间反应的差异动力学。
DOLs与其他少突胶质细胞之间的差异表达分析发现：DOLs显著上调26个基因（P<0.01和log2 fold change (log2FC)>1；图2f）包括与免疫信号相关的基因和非免疫相关基因。免疫相关基因包括Serpina3n，一种与免疫蛋白酶相关的丝氨酸蛋白酶抑制剂；补体成分C4b；几个主要的组织相容性复合体I（MHC-I）基因（H2-D1、H2-K1和B2m）；在非免疫上调基因中，有几个与神经炎症相关，如Klk6、Sgk1和外泌体相关的CD9和CD63。值得注意的是，最近通过单核RNA测序（snRNA序列）鉴定了类似的细胞。
为了研究可能控制DOLs诱导的信号通路和转录过程，作者及团队使用iRegulon对差异基因进行了基序富集分析。发现三个主要的转录因子（TF）家族：Stat/Irf、YY1/NF-κB（NES=6）和Sox9（NES=6）家族（图2g）。推测MHC-I基因和C4b通过Stat/Irf和YY1/NF-κB结合基序进行调节，而非免疫基因（Klk6和Sgk1）与Sox9 TF相关，Sox9是少突胶质细胞分化和成熟的关键调节因子。这些结果表明，与DOLs特征相关的DEG可能由一组有限的转录过程诱导，包括NF-κB和Stat/Irf家族的成员。
Fig.2 疾病相关少突胶质细胞状态的鉴定
3. DOLs与痴呆病理无关
考虑到5xFAD模型中观察到的DOLs在斑块出现后很久才检测到，因此作者猜测这种信号在多大程度上是淀粉样变特异性的？为此，作者重新分析了最近公布的数据集，其中包含WT和两种不同的认知障碍小鼠模型的海马细胞，包括一种tau病理模型（P301L）和一种结合tau病理和淀粉样变的模型（PS2/APP/P301L）（每组三只，19-22个月；图3a）。PS2/APP/P301L小鼠模型携带早老素2（PSEN2）、淀粉样前体蛋白（APP）和微管相关蛋白tau（MAPT）基因突变。在66002个细胞中，第一轮分析鉴定出了大量的脑细胞，包括高度丰富的少突胶质细胞（Mbp和Plp1，n=30787）、小胶质细胞（Cx3cr1和Hexb，n=13508）、星形胶质细胞（Slc1a2，n=3303）、内皮细胞（Cldn5，n=3262）、神经元（Nrgn，n=2252）、Cajal-Retzius细胞（Reln和Nhlh2，n=1787），T细胞（Cd3d，n=1263），周细胞（Kcnj8，n=1149），室管膜细胞（Tmem212，n=841），血管平滑肌细胞（Acta2，n=455），血管软脑膜细胞（Slc22a6和Inmt，n=312），神经元祖细胞（Tubb5和Smc2，n=188）和CP上皮细胞（Ttr，n=108）。对该数据集中的大量少突胶质细胞进行详细分析，识别出13个不同的簇（图3b）。为了进一步验证该聚类对应于DOLs，作者及团队进行了基因集富集分析（GSEA），观察到在簇11上调基因中DOL基因高度显著富集（图3d），进一步证实这些细胞类似于DOL。该数据集的结果与WT小鼠中几乎无法检测到DOLs、但DOLs在tau病理（P301L）模型和联合tau病理/淀粉样变（PS2/APP/P301L）模型均可检测到，表明DOLs不是5xFAD模型或淀粉样变的特异性（图3e）。细化分析小胶质细胞显示了11个不同的簇，其中两个表达典型的DAM基因，如Dkk2和Cst7。值得注意的是，与DOLs不同，DAM在纯tau病理模型中未被发现（图3f），这突出表明少突胶质细胞的反应与小胶质细胞不同，不是Aβ特异性的。
为了进一步证实这一发现，即DOLs不是由Aβ积累直接诱导的，作者培养了小鼠成熟的有髓鞘少突胶质细胞的原代细胞，并用不同聚集状态的Aβ1-42寡聚体、原纤维和斑块分别进行处理后进行RNA-seq分析。与对照组相比，处理组没有观察到DOLs信号基因的上调（图3g），进一步支持Aβ不直接或不能够导致少突胶质细胞激活。总之，Aβ累积后DOLs出现较晚以及体外研究对Aβ反应缺乏，表明5xAD鼠中DOLs的存在与痴呆的主要原因无关，而可能是少突胶质细胞对中枢神经系统损伤的反应。
Fig.3 DOL与痴呆的病因无关
4. 非AD病理中的DOL特征
基于上述结果，作者假设在淀粉样变和tau病理模型中鉴定的DOLs特征可能存在于痴呆以外的其他慢性CNS疾病中。为了验证这一假设，作者对三个先前发表的小鼠scRNA序列数据集进行了meta分析（图4a）。其中两个数据集来自自身免疫性脑脊髓炎（EAE）的脊髓，这是一种多发性硬化（MS）的实验模型。MS和EAE的特征是适应性免疫细胞渗入中枢神经系统引起的大量炎症和对少突胶质细胞的细胞毒性作用，导致其死亡和脱髓鞘。EAE是多阶段的，其特征是症状逐渐恶化（启动），炎症和临床条件均达到峰值，随后疾病严重程度和炎症程度降低，临床症状改善（缓解）。第一个数据集来自EAE高峰期小鼠的脊髓并与注射完全弗氏佐剂（CFA）的对照小鼠的脊髓进行比较。第二个数据集也来自EAE小鼠脊髓，包括EAE不同阶段的数据：启动、峰值和缓解以及注射CFA的对照。最后，第三个数据集来自年轻（3个月）和老年（28-29个月）小鼠的心室下区（SVZ）。使用单细胞降维聚类分群工具进行分析。所有数据集均含有丰富的少突胶质细胞（分别鉴定出1207、2552和4683个少突胶质）。在致病性和非致病性样品之间寻找差异基因（图4a）。在三个数据集中发现少突胶质细胞中病理相关基因的表达（图4b-d）显著富集DOL特征基因。有趣的是，在不同条件下观察到DOL信号的一些变化。例如，C4b在急性EAE和衰老模型中上调，但在多相EAE中不上调，而MHC-I基因在两种EAE模型中上调但在衰老中不上调（图4b-d）。作者还发现DOL信号的表达水平与EAE病程相关；表达水平在启动阶段升高，在峰值阶段达到最大值，并在缓解期间逐渐降低（图4e）。这些结果表明，少突胶质细胞反应的强度与疾病的严重程度相关，并且可能与炎症的强度相关。
非免疫性胶质细胞，主要是星形胶质细胞，通过脂多糖（LPS）改变基因表达引发系统性炎症作出反应，这种状态被称为“反应性星形胶质细胞”。在5xFAD小鼠海马中也观察到类似的星形胶质细胞特征，即疾病相关星形胶质细胞（DAAs）。有趣的是，DAA和DOL转录组特征部分重叠，因为两者都包括Serpina3n、H2-D1、B2m和C4b基因。最近发表的一项研究使用来自10x基因组学的Visium平台研究了全身注射LPS后小鼠脑切片的空间转录组。在这个实验环境中，是否会诱导DOL样反应，正如在小鼠大脑的神经炎症环境中发现的那样，作者测试了它与少突胶质细胞标记物的共定位。首先使用主题建模（方法）对数据进行无监督解复用：使用这种方法，作者确定了一个主题（编号8）：在LPS刺激样本中强烈表达，但在对照样本中没有。值得注意的是，对这个主题贡献最大的基因包含DOL特征的几个成员，称为DOL样特征。在LPS处理的小鼠中，Serpina3n表达显著高于对照组。在空间上，在第三脑室和侧脑室周围区域观察到DOL样反应，表明脑脊液携带的因素可能至少部分介导了这种反应（图4f）。接下来作者确定观察到的DOL样主题是否与少突胶质细胞相关，确定主题编号2富含少突胶质细胞标记物（Plp1、Mbp和Mog基因的高贡献），其跨截面的空间模式对应于白质的预期空间分布。两个主题的强度之间的相关性很低，表明DOL样特征也包括其他细胞类型的反应。事实上，在与此相关的基因中，发现了一些星形胶质细胞激活的标志物，如Gfap和Gja1，表明在系统性LPS攻击后，激活的星形胶质细胞也有DOL样反应。meta分析进一步证实了DOL反应是少突胶质细胞对中枢神经系统稳态失衡的病理性反应，这可能与多种疾病相关，包括AD。
Fig.4 非AD病理中的DOL特征
5. 小鼠和人脑切片中DOLs的空间分析
接下来，作者研究了DOLs在淀粉样变小鼠模型5xFAD脑中的空间分布。作为DOL信号的代表，使用蛋白质标记SERPINA3N，由与DOL状态最显著相关的Serpina3an基因编码。首先通过免疫荧光和共聚焦显微镜分析了16个月大的5xFAD小鼠大脑的冠状切片，并对其进行了OLIG2（少突胶质细胞谱系核标记物）、SERPINA3N、Aβ染色。在损伤区域（富含Aβ斑块）发现了OLIG2 SERPINA3N 双阳性细胞（图5a），而在WT脑中未观察到Serpina3an信号。为了进行广泛且定量的空间分析，作者使用同窝16个月大的5xFAD（n=4）和WT（n=2）小鼠，对OLIG2以及SERPINA3N和Aβ斑块的冠状脑切片进行染色，并通过使用滑动扫描仪扫描大脑皮质的大面积（平均11.5mm2）进行分析。为了自动检测细胞，使用最近发布的工具DeepCell（基于人工智能的活体细胞形态学辨识），使用分水岭分割法检测斑块（图5b），总共分析了309333个细胞。为了验证这种方法，作者及团队进行了质量控制，排除了样本间细胞大小或OLIG2强度的偏差。然后分析SERPINA3N免疫反应性。在5xFAD小鼠中SERPINA3BN 细胞的频率很高，但在WT小鼠中没有（图5c），在OLIG2 细胞中也可以观察到这种现象（图5d）。为了评估OLIG2 SERPINA3N 细胞的空间分布，计算了每个受检5xFAD大脑中这些细胞的Besag’L函数（图5e）。简言之，Besag ’L函数描述了给定半径（r）下点对（即OLIG2 SERPINA3N 细胞对）的平均数量。对于给定的r，与随机空间分布相比，正值或负值分别对应于“高于预期”或“低于预期”的对数。作者在四个受试大脑中观察到高度相似的情况，L功能的正值在10µm到300µm之间，峰值在50–70µm左右，验证了OLIG2 SERPINA3N 细胞不是随机分布在整个皮层，而是出现在离散区域。OLIG2 SERPINA3N 细胞的这种分布支持这些细胞与组织损伤的关联，进一步促使作者探讨它们与斑块区域的空间关联。
为了研究OLIG2 SERPINA3N 细胞与斑块之间的相关性，作者拟合了一个称为PenGE的惩罚空间吉布斯点模式模型。简而言之，提供范围值列表（30µm、80µm，160µm和300µm），PenGE以逐步函数的形式估计感兴趣对象之间最可能的势能函数，其中正值对应于“吸引”，负值对应于“排斥”。在通过该分析验证OLIG2 SERPINA3N 细胞不是随机分布的（图5f，蓝色）之后，分析OLIG2 Serpina3an 细胞和斑块之间的空间相互作用。在所有测试的大脑中发现30µm以下的正相互作用（图5f，红色）。因此，该分析表明OLIG2 SERPINA3N 细胞的空间分布可能与损伤区域（富含斑块）有关。
尽管先前使用snRNA-seq鉴定了与DOLs具有类似转录组特征的小鼠少突胶质细胞，但使用相同技术在人类中未发现此类细胞的证据。事实上，snRNA-seq显示出较低的灵敏度，因此不适合检测许多激活相关基因。为了进一步研究DOL信号是否与人类AD相关，作者重新分析了来自死后脑颞中回切片的空间转录组学数据。与对小鼠视觉样本的分析类似，采用主题建模方法，确定了由两个AD样本之一特异性表达的主题（图5g）。对最有贡献的基因的分析显示，第一个主题与巨噬细胞特异性和小胶质细胞特异性基因（C1QC、C1QA、AIF1和FCER1G）相关，而SERPINA3是第二个主题的最有贡献基因，以及一些炎性基因，如CHI3L1、VSIG4和SOD2。巨噬细胞特征显示出高度聚集的模式（图5h，中），而炎症部位在空间上更为分散（图5h，右）。高巨噬细胞区边缘的炎症强度较高。这些结果表明，DOL关键基因的表达，如SERPINA3，可能与人类AD有关。
为了检测在人类AD中表达DOLs关键特征的少突胶质细胞，作者对AD患者（n=8）和年龄匹配的非痴呆对照组（NDC，n=8）的大脑样本进行免疫组织化学分析。对颞叶皮质的20mm2区域进行了成像，包括灰质和白质。与小鼠一样，使用SERPINA3（SERPINA3N的人类同源物）和CC1（少突胶质细胞特异性标记物），以及硫黄素-S（细胞内和细胞外Aβ），共聚焦成像显示，在死后AD患者的颞叶皮质灰质中存在SERPINA3 CC1 细胞，但在NDC中不存在（图5i）。为了量化SERPINA3 细胞的发病率，作者同样使用pepiline图像对小鼠切片进行分析（图5b），共分析了475091个细胞。结果显示：与NDC切片相比，在死后AD中SERPINA2 的细胞显著富集（图5j）。有趣的是，作者观察到SERPINA3 细胞比例与简易精神状态检查（MMSE）评分之间存在显著相关性（图5k），表明SERPINA2可能是AD诱导的认知损伤的定量标志物。总之，利用空间转录组学和免疫组织化学分别在小鼠和人类中鉴定了SERPINA3N和SERPINA3，作为AD非免疫胶质细胞激活的关键标志物。
Fig.5 小鼠与人脑切片DOLs的空间分析
讨论
在这项工作中，作者使用scRNA-seq鉴定了一种少突胶质细胞状态（DOLs），该状态代表了一个共享的转录组模块，这种模块是对中枢神经系统稳态失衡的一种响应。这一转录组学模块似乎在不同的病理状态中很常见，其中的元素可能与人类疾病有关。在5xFAD小鼠淀粉样变模型中，DOLs出现在10月龄左右，此时小鼠的大脑已发生大量病理性变化，包括Aβ斑块积聚、胶质增生、炎症和认知障碍。这些结果表明，5xFAD中的少突胶质细胞与其他非神经元细胞相比对损伤的反应较晚，例如小胶质细胞、星形胶质细胞，表明这可能是累积损害的结果。虽然Aβ斑块附近发现DOLs，但它们在斑块积聚后很长时间才出现，加上体外实验结果显示Aβ本身不足以诱导它们出现，并且在未显示淀粉样变的模型中也发现了DOLs，这一事实证明Aβ不足以触发这种细胞状态。
在EAE中，少突胶质细胞前体细胞（OPC）和具有类似特征的成熟少突胶质细胞已显示具有吞噬能力，在MHC-II上呈递抗原并激活CD4 T细胞。在5xFAD中，与EAE不同，通过scRNA-seq对成熟少突胶质细胞（GalC ）的转录组学图谱进行深入分析，作者观察到仅MHC-I通路上调，而非MHC-Ⅱ上调，这意味着与CD8 T细胞的相互作用更可能大于与CD4 T细胞的相互作用。此外，最近的一项研究表明，在淀粉样变的情况下OPC可能会衰老。在成熟少突胶质细胞中，作者没有发现转录组水平上任何衰老标记物的证据。然而，要回答这些问题，还需要进一步深入描述OPC。与在5xFAD模型中的观察结果一致，发现EAE中DOL基因的表达水平随着疾病进展而增加，进一步支持损伤累积和DOL信号表达之间的关系。这些观察结果支持这种少突胶质细胞状态疾病的一般名称，无论其病因性质如何。
DOL和DAA之间的转录组学特征重叠，表明尽管星形胶质细胞和少突胶质细胞之间的功能存在根本差异，但它们具有相似的损伤反应分子途径（例如，Serpina3n、C4b和Ctsb上调）。小胶质细胞反应似乎更具病理特异性，如在淀粉样变中观察到的DAM，但在tau病理中没有观察到。值得注意的是，在星形胶质细胞和少突胶质细胞的共同特征中，也发现了一些基因，例如C4b55。需要进一步的深入研究以确定这些反应所起的作用，以及它们在开发有效的中枢神经系统疾病治疗中的靶向性。
使用免疫组织化学方法，作者在人类死后AD脑中检测到SERPINA3 少突胶质细胞。空间转录组学显示，巨噬细胞附近存在与炎症相关的高强度SERPINA3信号，进一步支持SERPINA3表达可能由炎症和损伤诱导的论点。然而，在免疫组织化学中使用了单一标记，并且空间转录组学缺乏单细胞分辨率，阻碍了作者对这些细胞进行充分表征，以确定与小鼠DOL的相似程度。结果还显示了大脑中SERPINA3 细胞的比例与MMSE评分之间的相关性，这表明SERPINA2可能是认知障碍的生物标志物。值得注意的是，Serpina3n显示出抑制颗粒酶B，从而保护细胞免受CD8 T细胞诱导的细胞毒性死亡。因此，需要进一步研究以阐明DOL的作用，特别是Serpina3n/SERPINA3，以及它们与人类疾病的相关性。总之，这篇研究报道了少突胶质细胞在不同神经退行性疾病条件下的共同分子途径，并强调了针对CNS疾病潜在的共同病理机制。
Kenigsbuch M, Bost P, Halevi S, Chang Y, Chen S, Ma Q, Hajbi R, Schwikowski B, Bodenmiller B, Fu H, Schwartz M, Amit I. A shared disease-associated oligodendrocyte signature among multiple CNS pathologies. Nat Neurosci. 2022 Jul;25(7):876-886. doi: 10.1038/s41593-022-01104-7. Epub 2022 Jun 27. PMID: 35760863.
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编 译：章天珍
校 审：陈 风
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