东北林蛙皮多糖抗衰老活性研究新型生物活性胶体纳米碳在去卵巢小鼠中的抗骨质疏松作用

Talatibaike Maimaitijuma1, Yang Jiao1, Yuan-Yuan Ma2, Bing-Xiao Yu1, Xin Yang1, Heng Liu1, Rui Wang1, Hao Wu1, Li-Ping Pan1, 曹永平*1, 张涛*3

1北京大学第一医院骨科，北京100034

2北京大学第一医院动物实验中心，北京100034

3北航材料科学与工程系，北京100191

1.介绍

骨质疏松症是一种全球关注的系统性疾病，影响着全球2亿多患者[1]，其特点是骨量低、骨强度降低、易骨折。骨质疏松性骨折在老年人中很常见，不仅增加经济负担，而且降低生活质量，威胁生命[2]。绝经后骨质疏松症是最常见的骨质疏松症类型，表现为骨转换率高，骨形成增强，甚至更强的骨吸收，最终导致骨质疏松。破骨细胞是哺乳动物唯一的骨吸收细胞，在绝经后骨质疏松症的骨吸收中占主导地位[3]。我们可以通过减少骨吸收或促进骨形成来改善骨量，在这种策略下，已经有许多药物针对破骨细胞或成骨细胞，如雌激素、双膦酸盐和特立帕肽。但由于严重的副作用或药物的非肠道给药方式[4]，它们的应用均受到限制，因此迫切需要开发新型的抗骨质疏松药物。

纳米碳材料具有高稳定性、良好的生物相容性和高细胞渗透性等独特的物理化学性质，近年来成为研究最多的领域[5]。目前研究的纳米碳材料包括富勒烯、碳纳米管、石墨烯/石墨烯氧化物和纳米金刚石。它们被认为是各种医学应用的

潜在替代品，如生物传感、组织工程、临床成像、癌症光热治疗和药物传递系统[6-8]。以骨缺损修复为主的骨科领域中，纳米碳材料主要被用作成骨载体，但其在骨质疏松症治疗中的应用却鲜有报道[9]。在这些纳米碳材料中，石墨烯是最有价值、研究最广泛的一种。然而，几乎所有的纳米碳材料（包括石墨烯）都具有时间、大小和剂量依赖性的细胞毒性（10）。

纳米碳材料作为“后起之秀”，具有多种不同功能的同素异形体目前尚未发现，通过表面改性可以将其生物相容性提高到极限。利用上述特点，开发出具有优良生物活性和生物相容性的新型纳米碳材料成为可能。在此，我们报告了一种新的纳米碳材料，称为胶体纳米碳（CNC），它在骨质疏松症的治疗方面显示出巨大的潜力。CNC的制备非常简单，只需要一步液相脉冲法，使CNC具有巨大的羟基。碳颗粒平均粒径约为50nm，形成链状微组织。在此，我们在去卵巢小鼠上应用CNC，并通过影像学、组织学、生物力学和血清学评估，研究其抗骨质疏松特性。相比一种新型药物，我们认为我们的研究将为骨质疏松症的治疗提供一个新的视角。

材料和方法

2.1 胶体纳米碳（CNC）的制备与表征

以纯度为99.9%、尺寸为100×30×5mm的石墨板为碳源，采用双石墨电极液相脉冲法制备CNC。为了进行TEM表征，将CNC浇铸到铜网格（300目；Ted Pella）上。在空气中干燥后，通过在200KV下操作的JEM-2100F透射电子显微镜（日本东京FTEM）观察样品。样品滴到硅板上并在空气中干燥。使用成像软件（Image J）在通过FTEM获得的颗粒直径上测量初级颗粒尺寸。使用动态光散射（DLS）光谱仪（日本大冢电子株式会社产品DLS-7000）评估所得样品的尺寸和分布。

2.2 动物和实验程序

所有动物实验均按照美国国立卫生研究院（NIH）《实验动物的护理和使用指南》的原则和程序进行，并事先得到北京大学第一医院动物伦理委员会的批准。简而言之，先将20只从北京维通利华实验动物技术有限公司购买的6周龄C57BL/6雌性小鼠适应2周情况。然后将所有小鼠麻醉并进行双侧卵巢切除术（OVX）。术后6周，随机取4只小鼠实施安乐死，分离其子宫并称重以确认OVX的效果。将其余16只小鼠随机分成两个相等的组：对照组（OVX PBS）和CNC组（OVX CNC）。之后，每天给16只小鼠灌服0.5mL的PBS或CNC（276μg/ml），每周2次腹腔注射0.5mL的PBS或CNC（276μg/ml），共计12周。在12周结束时对所有小鼠实施安乐死，将每只小鼠的左股骨和脊柱分别固定在4%多聚甲醛中用于组织学研究和显微CT、L5椎骨压缩试验。分离其内脏进行H&E染色，并收集血清用于评价生物相容性、CTX-1、PINP和TRAP水平。

2.3 试剂

石墨板（100×30×5mm，纯度99.9%）购自北京纪兴盛安公司（JXSHA Co., Ltd.，中国），CTX1和PINP ELISA试剂盒购自南京建城生物工程研究所，TRAP ELISA试剂盒购自北京雷根（Leagene）生物技术有限公司，TRAP染色试剂盒购自武汉赛维尔生物科技有限公司。

2.4 生物相容性评价

每组小鼠在给药开始和结束时称重。在整个研究期间，我们还监测了它们的体毛、情绪和反应。在研究结束时，处死所有小鼠并采血进行血清生化检测和全

血平板试验，取心、脑、肝、肺、肾等脏器行H&E染色。

2.5 微CT扫描

用显微CT（Investon，西门子，德国埃尔朗根）扫描固定的脊柱标本（每组n＝8），有效像素尺寸为8.82μm、80kV/500μA，曝光时间为每360个旋转步骤1500毫秒。使用Invon软件测量L5椎骨的每组织体积的骨体积（BV/TV）、小梁厚度（TT）、小梁数目（TN）和小梁分离度（TS）。

2.6 BMD扫描

采集标本后测量所有小鼠（未钙化）的解剖L5椎骨（每组n＝8）的骨密度（BMD），并采用双能x线吸收测定法（DXA）（美国Faxitron小动物活体成像系统UltraFocus）扫描每个椎骨。每个椎骨的BMD由1名盲于标本处理组的技术人员进行分析。

2.7 L5压缩试验

根据先前公布的方案，使用万能试验机（50KN，CA，美国）对分离的、未钙化的、完整的L5椎骨（每组n＝8）进行压缩试验[11]。加载速率为0.2mm/sec，初始力为1N，机械力的测量范围为2N-500N，相对精度为0.2%-0.4%。最后，利用荷载－位移曲线计算最大荷载（Fmax）、屈服荷载（yL）和刚度（S）。Fmax为接地板所能承受的最大力，yL为从弹性变形到塑性变形的弯曲点。用刚度衡量骨头的弹性。通过GraphPad Prism 6软件进行回归分析，以确定各组中参数的差异。同样，每个样品的数据由1名盲于标本处理组的技术人员进行分析。

2.8 H&E染色和抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色

分离左侧股骨（每组n＝8），在4%多聚甲醛中固定24小时，在10%EDTA中脱钙3周，然后用不同浓度的乙醇脱水并包埋在石蜡中。按照厂家指南，切割为厚度为6μm的纵切片，并用苏木精和曙红（H&E）以及TRAP（Sigma）染色。在高质量显微镜下对所有样品进行检查和拍照。红色的强度与TRAP活性成比例，使用Bioquant Osteo软件计算TRAP阳性多核破骨细胞数（N.Oc），并在6个独立的视野中通过总骨表面（BS）归一化（Bioquant图像分析，美国）。

2.9 骨转换指标：

从提取的眼球血中收集小鼠血清，在室温下凝结30分钟后在4°C下保存30分钟。然后将样品在3000×g和4°C下离心10分钟以获得血清。血清I型胶原交联C端肽（CTX-I）和血清I型前胶原N端前肽（PINP）水平按照厂家指南通过ELISA试剂盒（Beyotime，中国）测定。

2.10 统计分析

数据以均值±标准差表示，采用独立样本T检验分析确定CNC对两组骨微结构参数、血清骨转换指标和生物力学强度的影响。对于所有统计检验，p〈0.05表明各组之间存在显著差异。

结论

3.1胶体纳米碳（CNC）具有稳定的纳米结构

利用扫描电子显微镜（SEM）和透射电子显微镜（TEM）对CNC的形态进行了分析，图1a和图2b显示CNC的颗粒为球形链状纳米结构，粒径为50-100nm。通过动态光散射而得的粒径分布（图1c）显示，CNC的平均直径为174nm，这可能是由于CNC颗粒由于亲水性而聚集的结果。

3.2 胶体纳米碳（CNC）具有良好的生物相容性

处理12周后，所有BALB/c小鼠均存活，两组之间未观察到明显的体重下降（表1）。用药12周，两组反应、情绪、体毛无明显变化，血液化学分析结果显示，CNC组ALT、AST、肌酐（Cr）、Tbil水平明显低于PBS组，而全血板试验无显著性差异（表2）。此外，心脏、脑、肝、肺、肾、脾等内脏器官的H&E染色均未见明显组织学改变（图2）。

3.3 胶体纳米碳（CNC）改善OVX（卵巢切除）小鼠骨量和骨小梁参数

使用OVX小鼠骨质疏松模型研究CNC处理对骨质疏松的影响，通过明显的子宫萎缩所证实（表1）证实OVX的成功。为了评估骨量和小梁参数，我们进行了DXA和显微CT检查，CNC组的BMD 和TV/BV、小梁厚度（TT）、小梁数目（TN）的平均值显著高于PBS组，而CNC组的小梁间距（TS）显著低于PBS组（图3）。股骨的H&E染色和L5椎骨的不同显微CT剖面图也显示CNC组的骨量较PBS组明显改善（图4、图5）。

3.4胶体纳米碳（CNC）增强骨强度

为了评价骨强度，我们使用万能试验机进行L5轴压试验，如表1所示，CNC组的最大载荷（FMAX）和刚度（分别为92.1±4.29 N和126±4.41 N/mm）显著高于PBS组（66.9±3.10 N和126±4.41 N/mm）。这进一步验证了CNC对骨力学强度的有益作用。

3.5 胶体纳米碳（CNC）通过抑制破骨细胞活性改善骨质量

为探讨CNC抗骨质疏松作用的初步机制，给药12周后测定血清骨转换指标。CNC组血清CTX1和TRAP水平明显低于PBS组，而两组间PINP水平无显著差异（图6）。这表明CNC组的骨吸收较PBS组减少，我们通过股骨切片的TRAP染色进一步证明了这一假设，显示CNC组的TRAP阳性多核破骨细胞较PBS组明显减少（图7）。Bioquant Osteo软件检测TRAP阳性破骨细胞数（N.Oc）和每骨表面TRAP阳性破骨细胞数（N.Oc/BS），显示CNC组的N.Oc和N.Oc/BS明显低于PBS组（图8）。

探讨

骨代谢是一个动态过程，它需要在骨形成和骨破坏之间保持平衡，这是由机械应力、激素和细胞因子维持的[12]。骨质疏松症是由骨吸收异常引起的与全身性骨退化有关的代谢紊乱。

然而，异常骨吸收是破骨细胞过度增殖的结果[13]。对于治疗骨质疏松症，抑制破骨细胞的形成一直是主要的目标和策略之一，但目前的治疗临床上局限于副作用，如骨坏死、发热、胃肠道反应、心血管症状和癌症风险增加[14-15]。为了解决目前抗骨质疏松药物的不足，研究人员致力于开发副作用小、抗骨质疏松性强的新药。

然而，纳米碳材料可改变的物理和化学性质，其简单的合成技术，以及与各种配体和生物分子的高度功能化相容性，使其在医学应用中，包括生物成像、生物传感、癌症治疗和药物递送等方面有着惊人的用途[6，16-17]。纳米碳材料具有极高的表面积，每一个碳原子都暴露在表面，这有助于高效的功能化[18]。在骨科领域，纳米材料已被报道用于骨缺损修复和骨质疏松治疗的高级培训[19]。然而，越来越多的证据表明，纳米碳材料的持久挑战在于其生物相容性没有得到很好地改善[20]。理论上，纳米碳材料的生物相容性随粒径和功能化程度的变化而变化，因此我们开发了一种简单合成的纳米碳材料CNC，它具有丰富的羟基和良好的生物相容性。

SEM和TEM结果表明，CNC颗粒平均粒径为50-100nm，形成链状稳定结构。经CNC处理3个月后，小鼠未见体重减轻、神经行为改变，血液常规、生化指标及膀胱组织HE染色均未见异常或损伤，说明CNC具有良好的生物相容性。在CNC处理过程中不仅没有观察到不良反应，反而发现CNC降低了血清ALT、AST、Tbil和Cr的水平，这在其他纳米碳材料中尚未见报道，这使得我们进一步探讨CNC对肝、肾功能损害和代谢紊乱的治疗作用。

东北林蛙皮多糖抗衰老活性研究新型生物活性胶体纳米碳在去卵巢小鼠中的抗骨质疏松作用(1)

近年来，纳米碳材料在改善骨质量方面显示出了巨大的潜力，但与我们不同的是，它们大多发挥成骨作用，而不是CNC[21-22]那样的破骨细胞抑制作用。在本研究中，我们首先通过双侧卵巢切除建立了标准且被广泛接受的骨质疏松小鼠模型，然后通过影像学、组织学和生物力学评价验证了CNC的直接抗骨质疏松作用。根据显微CT结果，CNC对骨小梁TB/BV、TN、TT等参数进行了改善，表明CNC增强了骨的微观结构。CNC在组织学和影像学层面（micro-CT断面图）均能提高骨质量，较PBS组，CNC组的骨小梁更多，皮质骨更厚。在发现CNC的抗骨质疏松作用后，我们试图研究CNC对骨量影响的初步机制。如前所述，改善骨量的方法有两种，一种是通过促进骨形成，另一种是通过减少骨吸收。因此，我们测定了主要骨转换标志物的血清水平；CTX1和TRAP是骨吸收的代表，PINP是骨形成的主要标志物。如图6所示，CNC组的CTX1和TRAP水平较PBS组明显降低，而PINP水平两组间无显著差异，说明CNC可能通过减少骨吸收发挥抗骨质疏松作用。为了进一步证实这一发现，我们对小鼠股骨切片进行TRAP染色，评估破骨细胞的活性和数量，结果显示CNC组的TRAP阳性破骨细胞数量多于PBS组。本文首次报告了新型生物活性纳米碳材料CNC的合成及其体内抗骨质疏松特性。此外，我们还初步探讨了CNC对骨质疏松的影响机制，并认识到下一步应进一步深入研究CNC对骨质疏松的作用机制。此外，CNC在肾功能、肝功能、代谢

紊乱等方面的生物活性有待进一步研究。

图1 通过SEM、TEM和DLS测量的CNC颗粒的微观结构

图1 获得的CNC的代表性SEM（a）和TEM（b）图像。标尺，100nm（SEM）；50nm（TEM）。（C）通过动态光散射（DLS）测量所得的CNC的直径

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