撰稿 | 文刚(苏州医工所,助理研究员)

说明 | 本文是由论文作者投稿

对于生物医学研究,著名物理学家Richard Feynman有句名言:“…that it is very easy to answer many of these fundamental biological questions; you just look at the thing”。

这句话一定程度上说明了直接观察的光学显微镜对于生物医学研究的重要性。但是受光学衍射限制,传统光学显微镜的分辨率理论上只能达到光波长的一半。

近20年来,超分辨荧光显微成像技术的出现有效打破了光学衍射极限的束缚。基于单分子定位技术的超分辨显微镜(SMLM)受激发射损耗显微镜(STED)获得2014年的诺贝尔化学奖。结构光照明超分辨显微镜(SIM)作为另一种典型的超分辨显微成像手段,虽然没能获得诺贝尔奖,但由于成像速度快、光毒性小、无需特殊荧光标记等优势,已成为生命科学领域尤其是活细胞成像中最受欢迎的技术手段。

SIM成像通常采用余弦分布的结构化条纹光场照明样本,可将成像物镜无法直接探测的高频信号向下调制到其光学传递函数(OTF)的可探测区域被采集到,再利用复杂的后处理算法将目标高频信号从原始数据提取出来,从而获得最终的超分辨图像。完整的SIM成像过程包括高质量原始数据采集、与成像条件匹配的系统PSF/OTF标定,以及SIM算法重构处理。值得注意的是,SIM图像重构是一个极易产生伪影的病态逆过程,为减少重构伪影,几乎所有SIM算法对原始图像质量、使用的PSF的匹配度以及用户设置的参数等都有较高要求。

为追求最小化伪影的高保真SIM成像,科学家们在成像仪器构建、系统真实PSF标定、样本制备等方面提出了一系列高标准方法与操作指南。同时,SIM重构算法方面在结构光参数估计、迭代去卷积图像降噪、用户自定义参数精细调节等方面做了大量工作。尽管付出了如此多的努力,重建伪影在高质量原始SIM数据的超分辨图像中仍无法避免。此外,实际成像中经常会收集到大量调制对比度低、背景荧光强,以及信噪比低的原始数据,常规SIM算法处理这些次优数据时通常会产生更严重伪影。当前,SIM图像中的重构伪影损害了用户对技术可靠性的信心,而SIM成像在实验端和算法端的高要求则进一步限制了SIM技术的易用性。

近日,中国科学院苏州生物医学工程技术研究所李辉研究员课题组开发了一种基于点扩散函数工程(PSF engineering)的高保真SIM重建算法。

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艺术效果图:HiFi-SIM

该成果以 High-fidelity structured illumination microscopy by point-spread-function engineering 为题发表在 Light: Science & Applications

该算法有效克服了常规SIM算法极易产生重构伪影且光学层切能力差的问题,对不同质量原始数据的处理均能获得具有极少伪影和良好光学层切的高质量超分辨图像,有效提高了SIM成像的保真度。同时,该算法对OTF失配和用户自定义参数不敏感,使用生成的理论OTF和较少的参数即可重构高质量SIM图像,降低了SIM成像对实验实施和后处理重构的高要求,提高了SIM技术的易用性。

在本项研究中,研究团队深入研究发现:频域重建获得的SIM等效OTF偏离完美成像对应的理想OTF分布是造成重建伪影的本质原因。SIM等效OTF的理想形式应是宽场成像OTF经过有效频谱范围的简单放大得到,具有平滑和各向同性的特性。而SIM等效OTF存在明显的凹陷、凸起和对称性破缺等异常特征,这些异常特征在等效PSF上通常表现为旁瓣,如图1。

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图1 传统SIM和HiFi-SIM的等效OTF和PSF的对比

并且几乎所有的SIM算法都直接或间接采用Wiener去卷积进行频谱重组。然而,一旦估计的结构光条纹参数不准或使用的OTF与实际成像条件失配,Wiener去卷积获得的重建频谱中通常残留着与SIM等效OTF中相似的异常特征,这些异常频谱在最终的SIM图像中表现为伪影。此外,Wiener去卷积进行频谱重组还会放大位于重建频谱零频附近的残留离焦信号,最终限制SIM超分辨图像的光学层切性能。

在文章中,研究团队开发了基于频谱优化的高保真SIM重构算法---HiFi-SIM(High-Fidelity SIM reconstruction algorithm)。该算法包括预处理参数估计频谱优化三个步骤:

  1. 在预处理步骤利用生成的理论PSF对原始数据去卷积以提高图像对比度;
  2. 在参数估计中将归一化交叉关联法与频谱陷波相结合,使得交叉关联图中条纹波矢量对应的峰值点得以凸显,因此即使对TIRF-SIM和明显周期性结构样品的SIM成像均能自动确定准确的条纹参数,避免手动调参。
  3. 更重要地,HiFi-SIM对平移后直接组合的初始重构频谱实施两步频谱优化:首先构建初始优化函数W1(k)将直接组合的初始频谱对应的等效OTF矫正为具有相同数值孔径且与宽场成像OTF相同分布,然后构建去卷积优化函数W2(k)进一步消除优化后的OTF对高频信息的抑制。并且在两个优化函数中引入相应的权重函数用于分别去除残留离焦和主动补偿被衰减的有效信号,从而确保去除伪影时可避免微弱细节结构的丢失。通过两步频谱优化,HiFi-SIM可有效地消除重建频谱中的异常特征,最终获得高保真SIM超分辨图像。

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图2 HiFi-SIM的两步频谱优化流程

文章使用Argo-SIM标准片作为测试样本定量评估HiFi-SIM的保真度。利用商业化SIM软件、开源SIM软件和HiFi-SIM对相同原始数据进行比较重建,结果表明:HiFi-SIM可以更真实地还原样品结构,并且重建过程使用的经验参数对最终结果没有显著影响,如图3。因此大多数情况下HiFi-SIM仅需设置较少参数即可重构出高保真SIM图像,避免了其他SIM算法中复杂的用户参数调节问题。

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图3 使用Argo-SIM标准片定量评估重构图像的保真度

在此基础上,文章中利用HiFi-SIM对多种不同图像质量(高/低调制对比度,高/低信噪比、强背景)、不同样品复杂度(细胞微管、微丝、囊泡、线粒体等)、不同图像来源(GE/Nikon/蔡司的商业化仪器、自主搭建SIM系统、外部开源数据)的原始数据进行重建,并采用多种典型SIM算法作为基准进行对比,HiFi-SIM均展现出了最少的重建伪影和最优的图像质量。

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图4 典型SIM算法与HiFi-SIM重构结果的对比

特别地,HiFi-SIM的等效OTF具有零频附近区域下凹的特征,这使其具有比其他二维SIM算法更好的层切性能。利用HiFi-SIM对单层3D-SIM数据进行重构可获得与全3D-SIM重构中相同层结果相当的质量。并且,出色的层切性能使得HiFi-SIM可将囊泡等环形结构解析为中空环,有效改善了环形结构样本的2D-SIM成像质量。

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图5 HiFi-SIM对活的U2OS细胞中囊泡的解析

此外,文章定量分析了不同OTF参数对重建结果的影响,结果表明OTF参数在很大范围内的改变对重构图像的分辨率有稍微影响,但均不会产生明显伪影。因此HiFi-SIM较好地克服了其他SIM算法普遍面临的OTF失配的难题,使用生成的理论OTF即可重构高质量SIM图像,避免了过去SIM成像中要求严格标定系统真实OTF的专业化工作。

该研究开发了一种简单易用的高保真SIM重构算法,可用于对自建系统和商业化系统采集的2D-SIM和单层3D-SIM数据进行高质量重构。

与其他SIM算法相比,HiFi-SIM有效降低了SIM成像对实验实施和图像重构的高要求,预期可大大提高SIM成像的可靠性和易用性。同时,HiFi-SIM的重构结果可用于当前流行的基于深度学习的SIM算法的网络训练,有望提高这类算法的重构保真度。

此外,HiFi-SIM的频谱优化思想还可以进一步拓展到3D-SIM、非线性SIM、lattice-SIM等的图像重建。

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