引言
细菌感染是个「永恒三角」，因为有致病微生物的存在而使感染性疾病的诊治较一般疾病更为困难；真菌感染也是一个「永恒三角」，且更为复杂，因为除了涉及到的病原体真菌更为特殊外，还涉及患者的免疫状态和环境因素等，影响着疾病的进程。因此，在临床实践中，真菌感染的诊治较为困难，临床医师也容易出现一些诊治的误区。例如：自认为有一定的诊治经验，总是拿中性粒细胞缺乏（粒缺）患者的诊治经验套用于所有怀疑真菌感染的患者。当疑诊真菌感染，治疗中也存在误区，如开始治疗时首先选用氟康唑，不行就换伏立康唑，进一步换卡泊芬净，采用升阶梯疗法，而不是根据不同真菌采用不同治疗。总体表现为临床诊治中只有套路，没有思路。
近年来，无论国际还是国内，都发布了多个真菌感染诊治的专家共识或指南，给我们以极大的指导。无论哪一部指南，在涉及真菌感染的诊断时，如果要达到临床诊断或确诊的水平，都需要有病原微生物的检查结果，即真菌病原学检测是临床诊断或确诊的「金标准」。目前，在疑似真菌感染患者中，依然主要通过临床标本的常规实验室检测如呼吸道分泌物的涂片镜检和培养（AI级证据），这是真菌感染实验室检测的「基石」，即基础检查。但培养方法虽有助于提供流行病学和真菌药敏的信息，在对真菌进行鉴定时却敏感性较低。随后，真菌感染生物标志物如1-3-β葡聚糖（G）和半乳甘露聚糖抗原（GM）检测（AII级证据）给临床提供了非常有用的指标。随着近年来分子生物学技术如PCR对真菌 DNA 扩增（AII级证据）和宏基因二代测序（mNGS）诊断已经广泛应用于临床，我们目前更迫切需要的是认真思索这些检测技术的合理应用。
GM试验在真菌感染诊断中具有哪些价值与意义？在判读GM试验结果时需要注意哪几个方面？GM是曲霉生长时分泌的一种多糖抗原标记物，是诊断早期侵袭性曲霉病（IA）的指标，特别是严重免疫抑制/粒缺患者IA的有效诊断工具。2016年版美国感染性疾病学会（IDSA）制定的曲霉病诊疗指南及其他真菌感染指南都推荐GM试验作为诊断IA的生物标志物。但在判读GM试验结果时，需要注意以下几点。
1、折点的变迁：早期血清GM试验诊断曲霉病的推荐折点为单次0.5，2018年之后，建议如果以0.5为折点应该连续两次阳性，单次检测时折点应为0.7或1.0。2019年EORTC/MSG第三版侵袭性真菌病（IFD）指南再次做出修订：①推荐检测血清、支气管肺泡灌洗液（BALF）、血浆和脑脊液中GM诊断 IA；②单次血清或血浆：阈值＞1.0；③单次BALF＞1.0；④单次血清或血浆：阈值＞0.7，以及BALF＞0.8；⑤脑脊液＞1.0。同时强调：不同临床标本应采用不同阈值，但不同疾病类型的阈值应该相同（如急性、慢性、变应性），成人和儿童适用相同的GM阈值。
2、抗曲霉治疗对GM检测的影响：抗真菌（能够覆盖霉菌的药物）治疗对血清GM 结果有明显的干扰，可降低血清GM的诊断率。有文献报道，接受抗霉菌治疗或预防的患者GM诊断IA的敏感性为52%，未接受预防的为89%（p=0.02）。临床医生在判读GM检测结果时，一定要关注患者是否应用过抗真菌治疗和对GM的影响。
3、粒缺和非粒缺患者GM试验结果的差异：Meta分析显示：诊断IA时，免疫抑制患者GM试验的敏感性和特异性无论血清还是BALF都非常高，血清GM检测的敏感性为71%-85%，特异性为88%-89%；但在非粒缺非免疫抑制患者，血清GM检测的敏感性降至11%-38%，特异性还可以为维持在87%，但BALF GM检测的敏感性依然高达82%-84%（IA）和68%-78%（慢性肺曲霉病，CPA），特异性为88%-98%。因此，非粒缺患者血清GM试验阴性不能排除IA，应该力争做BALF GM检测才有价值。但应该注意行BAL的标准化，包括灌洗量、回收量、血性、痰性、灌洗技术等会显著影响结果。
4、GM检测对突破性感染的诊断价值：尽管在接受抗霉菌活性药物预防或治疗时GM检测的敏感性降低，但当临床怀疑程度较高时，抗原检测如GM（在BALF和血清中）、G试验（仅在血清中）对于诊断突破性IA仍然具有重要作用，因为此时真菌培养的敏感性可能更低。同样，基于多种抗原、传统技术诊断，以及PCR检测和新型诊断标志物的联合应用，可以协助诊断突破性霉菌感染。
5、GM对疗效评估的作用：抗曲霉治疗1周后患者的GM变化趋势可以作为预测治疗结局的影响因子。一项全球研究比较了12周抗真菌治疗有效和12周治疗无效两组患者血清GM水平的变化趋势，结果显示伏立康唑治疗后的变化趋势体现在1-2周，两性霉素B体现在第4周。
6、GM试验的干扰因素：GM试验假阳性因素：① 抗菌药物：阿莫西林/克拉维酸、头孢吡肟、头孢哌酮/舒巴坦、头孢曲松、碳青霉烯类、亚胺培南/西司他汀；② 其他IFD（青霉、镰孢霉、组织胞浆菌、皮炎芽生菌等）；③ 新生儿双歧杆菌定植；④ 多发性骨髓瘤。GM试验假阴性因素：① 非粒缺患者；② 慢性肉芽肿。
小结
1、GM对IA有重要的临床诊断意义，尤其在粒缺患者血清GM的意义重大；
2、预防性或前期应用抗霉菌治疗明显降低血清GM的诊断价值；非粒缺患者血清GM检测的敏感性明显下降，阴性不能除外感染；
3、非粒缺或预防性应用抗曲霉治疗患者推荐检测BALF GM，不同标本检测GM的阈值不同；
4、GM推荐的临床阈值：单次（血，BALF，CFS）：＞1.0，同时检测：血清：＞0.7，BALF：＞0.8；
5、GM的动态监测，可以反映治疗的疗效；但GM检测有一定的影响因素。
G试验在真菌感染诊断中具有哪些价值与意义？……G试验检测试剂盒因国内种类众多，质量良莠不齐，判定标准不一，结果解释需谨慎G试验是以真菌细胞壁特有的（1-3）-β-D葡聚糖为标记物的检测方法，在IFD诊断中能检测念珠菌、曲霉、耶氏肺孢子菌、毛孢子菌、镰刀霉、支顶孢霉等，但不能检测隐球菌、毛霉。因此，G试验为泛真菌检测生物标志物。目前，国内外指南推荐应用G试验诊断IFD。
1、推荐应用G试验的建议：用于IFD的早期诊断（先于临床症状4天，早于发热5天，早于呼吸道症状11天，血培养报阳前10天）；对真菌感染的高危患者每周2次动态监测可以提高其特异性；与多种方法联合使用，可以协助诊断突破性IA。G实验检测仅适用于血清样本，采用Fungitell法判断阳性采用单边阈值（＞80 pg/mL）。
2、G试验的临床应用：在高危患者，G试验连续2次阳性诊断侵袭性念珠菌病（IC）的准确率较高（敏感性为100%，特异性为75%），阳性预测值为30%，阴性预测值为100%。总体而言，G试验诊断曲霉、念珠菌和耶氏肺孢子菌感染有较高的敏感性和特异性。特定临床状况下G实验可用于IFD 的「临床诊断」，包括伴或不伴中性粒细胞减少的血液系统恶性肿瘤、HSCT术后中性粒细胞减少，以及某些入住ICU的IC 高风险（＞10%）患者（胃肠手术后复发性吻合口瘘、上消化道穿孔、坏死性胰腺炎后继发感染）。由于G试验对任何一种IFD都不是特异性的，故不能确诊IA或IC。
3、诊断non-HIV患者耶氏肺孢子菌肺炎（PJP）：此类患者罹患PJP时诊断更困难，因为医生的警惕低，传统检测方法的敏感性低。PJP 高危患者的宿主因素包括过去60天内接受治疗剂量的皮质激素至少2周，接受抗肿瘤、抗炎或免疫抑制治疗，CD4淋巴细胞计数降低（原发性免疫缺陷、血液系统恶性肿瘤、SOTs和异基因HSCT受体患者）；临床症状往往是非特异性的，如咳嗽、呼吸困难和低氧血症；影像学改变主要为双侧毛玻璃样影，少见的有实变、小结节、单侧浸润影、胸腔积液和囊性病变。可以采用实时定量PCR扩增BALF、痰液或漱口液中耶氏肺孢子菌DNA，优于定性PCR，有助于临床诊 PJP。在排除其他IFD后，2次或2次以上的血清G试验≥80ng/L也可用于PJP的临床诊断。G试验阴性排除PJP的价值要高于阳性诊断PJP。
4、G试验干扰因素（更多，结果解读应谨慎）：G试验假阳性因素：① 纤维素膜（含葡聚糖成分）进行血液透析；② 血液制品（白蛋白、凝血因子、免疫球蛋白等）；③ 抗菌药物（磺胺类药物、阿莫西林/克拉维酸、多粘菌素、厄他培南、头孢唑啉、头孢噻肟、头孢吡肟）；④ 革兰阴性菌菌血症；⑤ 黏膜炎或胃肠黏膜受损；⑥ 手术时应用的纱布或海绵（含葡聚糖成分）；⑦ 抗癌药物 (含葡聚糖如香菇多糖) 。G试验假阴性因素：① 隐球菌和毛霉感染；② 抗真菌药使用。
特别需要提请大家关注的是G试验检测试剂盒的质量问题，国内试剂种类众多，质量良莠不齐，判定标准不一，临床应用价值令人担忧，结果解释更需谨慎。
小结
1、G实验在IFD诊断中有重要的临床诊断意义，尤其在除隐球菌和毛霉外的多种真菌感染，为国内外指南所推荐；2、G试验是早期检测方法，先于临床症状 4天，早于发热 5天，早于呼吸道症状 11天，血培养报阳前 10天内呈阳性；3、目前只认可血清G实验检测，但目前试剂盒众多，阈值不一，解读时应谨慎；4、对于念珠菌血症, G试验是首选检查方法；对于肺孢子菌感染也有很大的价值，但干扰因素较多；5、对于是否停止IC高危患者的经验性抗真菌治疗有重要参考价值。
真菌特异性IgG抗体在真菌感染诊断中的价值与意义……关于CPA的诊断、ABPA的诊断、血清念珠菌抗体检测在IC诊断中的意义，以及真菌抗体检测的干扰因素解读真菌特异性抗体检测既往在IFD的诊断中并未受到重视，因为担心免疫缺陷患者往往无法产生抗体，或急性侵袭性感染还来不及产生抗体。后来发现在非粒缺患者罹患IA时血清抗体检测敏感性高于粒缺患者，而在慢性真菌病尤其是CPA体现了极高的诊断价值。随后的研究证实，即使在侵袭性肺曲霉病（IPA）血清特异性曲霉IgG抗体的阳性率也高达65%。目前用于临床的真菌特异性抗体检测主要是曲霉和念珠菌抗体。
1、CPA的诊断：欧洲（ERS-ESCMID）CPA诊断与治疗指南（2015年版）推荐曲霉特异性IgG抗体检测（对有空洞或结节的CPA）为A级（最高推荐等级）微生物诊断标准。美国IDSA曲霉病诊断与治疗指南（2017年版）和欧洲（ESCMID-ECMM-ERS）曲霉病的诊断与治疗指南（2016年版）也都推荐曲霉特异性IgG抗体检测是慢性空洞性肺曲霉病最敏感的微生物检测方法。
2、变应性支气管肺曲霉病（ABPA）：中国ABPA诊治专家共识（2017年版）推荐，诊断ABPA必须具备第一项、第二项和第三项中的至少2条；其中第二项为必需条件：①烟曲霉特异性IgE水平升高，或烟曲霉皮试速发反应阳性；②血清总IgE水平升高。从诊断标准中可见，通常我们认为最为重要的曲霉培养阳性和GM试验反而不是诊断的必备条件，说明曲霉特异性IgE抗体检测在ABPA诊断中的价值。
3、血清念珠菌抗体检测在IC诊断中的意义：目前已经应用于临床的抗体有：①抗念珠菌烯醇化酶IgG抗体（anti-Eno IgG）；② 抗甘露聚糖（mannan antigens，Mn）抗体，可以与甘露聚糖抗原（Mn）联合检测；③ 抗念珠菌果糖二磷酸醛羧酶（Fba1）抗体；④ 抗白念珠菌芽管抗体（CAGTA）。抗体检测的意义：IC早期快速诊断；区分念珠菌的定植与感染；与其他真菌无交叉反应；联合检测可以提高阳性率。
4、真菌抗体检测的干扰因素：曲霉IgG抗体检测的干扰因素：① 组织胞浆菌、球孢子菌感染交叉造成假阳性；② 血液制品，免疫球蛋白治疗造成假阳性，但是一般阳性数值会很快下降；③ 抗真菌药对抗体影响：小于抗原，但长期抗真菌治疗还是可对抗体浓度造成影响。念珠菌抗原、抗体检测的干扰因素：① 念珠菌Mn试验假阳性的影响因素：抗病毒药物阿昔洛韦、伐昔洛韦；② 念珠菌IgG抗体假阳性的影响因素：丝孢子菌、隐球菌交叉反应造成假阳性，血液制品，免疫球蛋白治疗。
小结
1、血清曲霉特异性IgG抗体在曲霉球、CPA诊断中是最重要的微生物学证据；2、血清曲霉特异性IgG抗体可以用于监测抗曲霉治疗的疗效，有助于区别定植与感染；3、曲霉抗原抗体联合检测，能覆盖更多的曲霉感染人群，对IPA也有一定的辅助诊断价值；4、曲霉特异性IgE是ABPA诊断的必备条件；5、血清念珠菌抗体检测可早期快速诊断IC，联合检测可以提高阳性率。
mNGS在真菌感染诊断中有哪些价值与意义？……每个「G」都有自己最适合的检测地位，要分清「地盘」，需要结合临床评估才有意义mNGS的优势在于没有偏移性、广覆盖和高效率，应用临床后受到广大医生的欢迎。分子生物学在病原微生物检测中应用一直不温不火，近年来欧洲做了更多脚踏实地的工作，2008年真菌PCR倡议工作组在经过严格验证后，曲霉 PCR 检测技术标准取得重大进展，并开始用于临床。
2019年欧洲指南（EORTC/MSGERC对IFD定义的修订和更新共识）首先确定了PCR检测和DNA测序在IFD确诊中的价值。曲霉：无菌部位微生物学分析/培养、血培养、组织核酸诊断（福尔马林固定、石蜡包埋的组织中发现霉菌时，PCR扩增真菌DNA，并结合DNA测序）。念珠菌：无菌部位微生物学分析/培养、血培养、脑脊液血清学分析（适用于隐球菌脑膜炎）、组织核酸诊断（福尔马林固定、石蜡包埋的组织中发现酵母菌时，PCR扩增真菌DNA，并结合DNA测序）。其次明确了PCR检测在IA临床诊断中的价值。曲霉PCR检测（以下任意一项）：① 血浆、血清或全血连续 2 次或以上PCR检测阳性；② BALF重复2次或以上PCR检测阳性；③ 血浆、血清或全血至少1次PCR检测阳性，同时BALF至少1次PCR检测阳性。2019 美国胸科学会（ATS）在真菌诊治指南也提出了PCR在IA中的诊断建议：对于严重免疫功能低下疑似存在IPA时，建议应用血液或血清曲霉PCR检测（强推荐，高级质量证据）；对于严重免疫功能低下的患者，建议进行BALF（包含曲霉）PCR的检测作为评估的一部分（强推荐，高级质量证据）。
1、分子生物学应用于真菌检测的现状：分子生物学已经成为真菌感染病原学检测的重要方法；PCR检测已经广泛应用于临床，部分可以作为真菌感染的诊断依据。mNGS刚刚在临床普及，正在积累经验，可以作为辅助诊断的指标，但尚不能作为病原学确诊依据；但mNGS给临床提供了一种高敏感、特异的病原微生物检测方法。
2、mNGS检测真菌的优与劣：① 优势：不需要培养，节省时间；相较传统方法（G/GM试验）可以精确区分物种，甚至亚型，特异性高；在某些类型真菌的检测敏感性高于传统方法，比如曲霉；无需假设，可覆盖罕见真菌和其他类型病原体；可检测真菌的耐药基因。② 劣势：对采样要求较高，需要有效采集真菌感染的病灶部位；真菌细胞壁厚（如曲霉），或有坚固荚膜（如隐球菌），破壁困难，核酸不易释放，可造成假阴性；湿实验流程（比如建库）容易引入环境真菌或试剂中真菌核酸（如灰绿曲霉），的污染，造成假阳性；真菌基因组数据库不全，很多真菌缺乏全基因组数据（识别不出），且在公开的数据库中真菌序列经常存在人源序列的污染（识别错误）。
3、mNGS检测真菌的技术特点与注意事项：对于临床最常见的肺部真菌感染来说，最好的检测标本依然是BALF；优化破壁技术，提高核酸提取率；恰当合理的去人源技术，提高诊断的敏感性；对真菌的数据库进行验证、清洗和补充。
4、mNGS检测的干扰因素：① 假阳性的干扰因素：标本采集时、检测过程中的污染；背景微生物和开放部位定植菌的干扰；检测结果难以区分感染与定植病原菌；检出常规检测中少见病原菌的判断。② 假阴性的干扰因素：标本中病原菌数量过少，人源背景细胞过多；病原体如分枝杆菌、真菌，细胞壁过厚，或躲避在巨噬细胞内难以破壁获得，核酸提取过程中的损耗；PCR扩增过程中的偏好；比对数据库的不全。
5、mNGS检测结果解读（查到哪种真菌）：分析检测出病原微生物的致病性：① 高等级的致病性真菌：如曲霉、肺孢子菌、马尔尼菲篮状菌、新生隐球菌，在大部分样本中都可能是病原体。② 中等级的条件致病菌：如念珠菌属，在外周血、脑脊液、穿刺液等无菌体液样本中可能是病原体，但在痰液、BALF、尿液中可能是共生菌，需结合临床特征慎重判断致病可能性。③ 低等级的条件致病菌：如念珠菌，在外周血、痰液、BALF、尿液等大部分样本中可能是共生菌，只在少数情况下如侵入操作后的脑脊液/外周血样本、感染性心内膜炎的赘生物中可能致病。④ 疑似背景微生物引起感染：在某些感染样本中能与低等级的条件致病菌相互转化。
6、mNGS检测报告解读（如何结合临床）：① 阳性结果判读：若mNGS结果符合患者的临床表现和其他实验室检查，推荐根据mNGS结果指导临床决策。若患者mNGS结果阳性且符合临床表现，但缺乏除mNGS结果外的其他实验室支持证据，应进行PCR验证，并进一步完善传统实验室检查加以验证。若患者mNGS结果阳性，但临床表现或实验室检查结果不支持该结果，则不能仅根据mNGS结果进行诊断，而应以传统实验室检查结果为首要临床参考依据。② 阴性结果判读：真阴性，排除感染；假阴性，根据其他辅助检查结果高度提示感染可能，建议再次重复mNGS检测。
小结
1、分子生物学已经在临床实践中广泛应用，其中PCR在曲霉和念珠菌感染病理标本中具有确诊价值；2、mNGS刚刚在临床普及，正在积累经验，可以作为辅助诊断的指标，但尚不能作为病原学的确诊依据；3、mNGS给临床提供了一种高敏感性、特异性的病原微生物检测方法；4、正确应用：mNGS不应用于普通感染，而是疑难、危重、特殊感染患者，目前尚不提倡用于疗效随访和耐药性检测；5、重点关注：mNGS报告的正确解读：小心谨慎，结合临床，综合评估。
综上所述，每个「G」都有自己最适合的检测地位：① BALF-GM，追捕IPA舍我其谁焉？② 血清G实验，最爱念珠菌血症；③ 血清曲霉IgG抗体，CPA的首选；④ mNGS，疑难、危重、特殊感染我当家。无论谁的「地盘」，都需要结合临床评估才有意义。
主要参考文献：
1. Donnelly JP, Chen SC, Kauffman CA, et al. Revision and Update of the Consensus Definitions of Invasive Fungal Disease From the European Organization for Research and Treatment of Cancer and the Mycoses Study Group Education and Research Consortium. CID,2019.
本文完
排版：Aurora
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