功能性肠道类器官
撰文：赵宇煊、王霞
来源：细胞世界
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民，以食为天。我们的生活中充满着美食的气息，我们常以“吃货”称呼自己，汪曾祺先生在《人间至味》中也不乏令人垂涎欲滴的描写。不管是五谷杂粮，还是山珍海味都要靠我们身体中的肠道进行营养吸收，给我们提供源源不断的能量。但俗话也说，病从口入，我们的肠道不断受到进食压力以及细菌和毒素的挑战，随时可能破坏肠道功能并产生损伤。
面对这些损伤压力，肠道中的细胞会持续死亡，但是肠道中的干细胞会源源不断地产生出新的细胞，进行补充和修复。因此，
肠道干细胞是肠道守护神，时刻维持肠道稳态和功能发挥。
我们的肠道是一个同心管，在解剖学上讲，从胃到肛门的连续管是由小肠和大肠组成。小肠包括十二指肠、空肠和回肠。肠壁由四层组成：最内的粘膜层（上皮层）、粘膜下层、固有肌层和最外的浆膜层。
哺乳动物肠道上皮是单层柱状上皮结构，包含吸收型细胞和分泌型细胞，这两类细胞定义了肠道器官的两个主要功能：分泌功能和吸收功能。分泌型的细胞分泌激素、粘液和抗微生物肽等，对微生物、毒素和抗原等起到重要的屏障防御作用；吸收型细胞的作用是吸收食物中的营养成份。
1 肠道干细胞
干细胞促进组织的发育、更新和再生，它们犹如细胞的制造工厂，是生物体内细胞自我更新、补充新生细胞以及应对应激损伤修复的主要来源。我们的肠上皮有着快速的细胞更新能力，大约每3~5天更新一次，而新肠上皮细胞的产生是由肠道干细胞不断增殖分化实现的。
肠道干细胞是各类型肠道细胞的库来源，提供新生力量使肠道始终保持着新鲜的活力。在肠道中，突起的肠绒毛之间存在一些内陷，称为隐窝。肠道干细胞则位于隐窝基底位置，与潘氏细胞相间排列。
图1. 稳态下肠道隐窝模型及肠道干细胞分化命运：处于稳态时，肠道干细胞位于隐窝基底处并逐渐向上迁移分化为成熟细胞 (de Sousa E et al. Cell Stem Cell. 2019)Barker等人，在2007年发现一类肠道干细胞特异性标志物Lgr5，自此为肠道干细胞的相关研究提供了干细胞体内追踪的研究策略，即谱系追踪策略。这是一种通过对一类细胞的特异性标志基因进行标记从而揭示其后代细胞命运的技术，极大地促进了我们对肠道干细胞的理解。
如图1所示，经过标记物谱系追踪研究，研究者发现肠道干细胞产生的过渡增殖细胞（Transit amplifying cell，TA细胞）是从隐窝底部逐渐向隐窝顶部上移，并进一步分化成多种肠道类型细胞。过渡增殖细胞首先产生分泌祖细胞和吸收祖细胞，随后分泌祖细胞分化为成熟的杯状细胞、肠内分泌细胞、潘氏细胞；吸收祖细胞则分化成肠吸收细胞。分化的成熟细胞最终会迁移到绒毛的顶端逐渐凋亡，而后它们被下方新迁移上来的细胞所更替。
2 肠道干细胞可塑性
近年的一些研究提出了一种肠干细胞的动态模型，即肠上皮中的某些细胞类型可以去分化并恢复一些干性功能（图2）。这些细胞类型可以作为肠干细胞的替代来源，在组织损伤、炎症等情况中发生作用，用以补充受损的肠干细胞。
研究者发现，当发生肠道急性损伤导致Lgr5阳性肠干细胞缺失时，肠道会触发再生反应以恢复自我更新。在干细胞损伤期间，隐窝的细胞是高度动态的，来自不同谱系存活的非肠干细胞可以回到隐窝基底的位置，在那里它们可以恢复到表达Lgr5的干细胞状态。此时，新的干细胞开始快速增殖来补偿丢失的细胞数量，使得肠隐窝细胞数量发生短暂扩增以及随后产生隐窝裂变来重新填充肠道组织受损的部位。
在肠干细胞分化命运的研究中，通过Dll1标记的分泌型祖细胞的谱系追踪，发现其不仅可以产生成熟的分泌型后代细胞，还可以产生吸收型细胞。并且在干细胞大量损伤的辐射处理后，其被标记的后代还产生了部分Lgr5阳性的肠干细胞，暗示着分泌型祖细胞不仅有着分化成更多肠道成熟细胞类型的多能性能力，还有着去分化返回为肠道干细胞的能力。
同时，其他的细胞类型也被报导具有去分化为肠干细胞的能力，包括Atoh1阳性的潘氏细胞、Prox1阳性的肠内分泌细胞、Alpi阳性的吸收型肠上皮细胞、Ascl2阳性的吸收型祖细胞等。肠道隐窝细胞的动态可塑性为理解肠道干细胞库提供了新的可能，也使我们认识到肠道强大的再生能力。
图2. 损伤再生状态下的肠道隐窝动态模型：在发生肠道干细胞急性损伤时，隐窝中的一些非干细胞向下迁移返回基底处重新获得干性（de Sousa Eet al. Cell Stem Cell. 2019）3 肠道干细胞与其微环境
肠道细胞的命运不仅仅由胞内的基因控制，还受到周围微环境信号的影响。每个细胞好比是一个独立的人，微环境就如同我们的友谊、亲情、社会关系等。人与人之间的联系与关系影响着我们的行动，而细胞之间的信号也同样在影响着它们的命运。干细胞微环境是维持干细胞自我更新和增殖所必需的信号来源。肠道干细胞的微环境包括肠上皮侧（肠腔）微环境和基底侧微环境。
肠道干细胞位于隐窝的底部，在小肠中与潘氏细胞相邻。在那里，肠道干细胞被含有各类信号因子的环境所包围，同时与肠上皮顶端接触到的菌群代谢物和食物营养素组成的外环境，共同塑造了肠干细胞的上皮侧微环境。与此同时，在肠上皮下层存在的众多微环境细胞（包括基质细胞及免疫细胞等）共同构筑了基底侧微环境。该微环境的细胞群产生信号通路相关配体和可溶性细胞因子、趋化因子和生长因子，调节干细胞的行为。一些关键信号通路如Wnt和R-spondin信号对肠道干细胞的自我更新和增殖至关重要，而BMP信号平衡着干细胞的维持或分化命运。其中，分化后没有向上迁移而是定居在隐窝底部的潘氏细胞产生的微环境因子是维持邻近干细胞干性的必要信号。此外，Yilmaz等人的研究还提出潘氏细胞还可能是肠道干细胞感受外界营养的“传感器”，以感受器的方式促进干细胞行使正常功能。
这些微环境信号滋养干细胞，维持肠上皮充分的周转更新，巩固功能有效的上皮组织与过度生长之间的稳态平衡。肠上皮侧或是基底侧的不同微环境因子影响肠干细胞的活性，调控着肠道干细胞在正常生理条件下的稳态平衡或是损伤状态下的再生修复过程中的命运。
图3. 肠道干细胞的微环境：肠道干细胞的命运与其基底侧微环境和肠上皮侧微环境紧密相关（Santos AJM, et al. Trends Cell Biol. 2018）4 肠道干细胞与类器官
体外细胞培养技术是生物学中常用的研究细胞特点和功能的方法，这些技术一直致力于向更贴近体内生理特征的方向上发展。
早在20世纪80年代，研究人员就建立了肠上皮的细胞系，仅包含单一的肠上皮细胞类型。然而，由于肠上皮细胞的多样性和复杂性，细胞系不能准确研究肠上皮的功能。随后1992年，研究者报道了乳鼠原代肠上皮细胞体外3D培养的方法。经过这些方法的改进，可以成功地培养人类胎儿来源的肠上皮。然而，这些方法仅能在体外培养原代细胞2周，无法完全模拟肠上皮细胞的长期更新。
Sato等人，在2009年建立了类器官的3D培养方法。这种三维培养技术使成年哺乳动物干细胞显示出其显著的自组装特性，所产生的肠上皮细胞有极性地有序排列，具有类似隐窝、绒毛样的结构域，包含肠上皮中的主要细胞类型，并保留了营养吸收和屏障功能等功能性特征。在该系统中，肠道隐窝甚至单个Lgr5阳性干细胞可以在Matrigel基质上用包括R-Spondin1、Noggin和EGF等微环境因子的培养基形成肠类器官，并能进行长期培养。值得注意的是，肠类器官只包含上皮组织的细胞类型，不包含肠道内基底组织等微环境细胞，但可以通过与基质细胞、免疫细胞共培养等方式对肠类器官进行优化。
肠道类器官可以用来模拟肠道器官的发育以及肠道疾病的病理过程，肠道类器官技术已经被应用在多个肠道相关疾病研究中。有研究表明，肠腺瘤中的Lgr5阳性细胞可产生所有其他腺瘤细胞类型。因此，类器官培养系统已成为探索肿瘤生物学的一种有希望的新工具。全外显子基因组测序表明，结直肠癌肿瘤细胞的突变谱和拷贝数变化在类器官中得到了忠实的再现。另外，我们的肠道因为其所处的微环境不断受到细菌和毒素的挑战，其不可控性和复杂性使得利用动物模型在体内模拟该病理过程有很多的限制因素和不确定性。利用类器官技术模拟细菌与肠上皮细胞的相互作用或毒素诱导的肠上皮损伤，相比动物模型更容易操作。同时可以消除人与动物之间的差异，更具代表性。
此外，肠道类器官在再生医学领域具有广泛的应用。类器官还可以用于构建肠道遗传疾病模型，患者来源的类器官有望实现个性化的药物预测，基于类器官的细胞移植可以补充受损肠上皮，类器官还可与基因编辑技术相结合用于基因治疗等（图4）。
图4. 肠道类器官的应用：肠道类器官在肠道疾病病理研究和再生医学领域具有广泛的应用
（Zhao Q, et al. J Genet Genomics. 2020）
5 肠道干细胞与疾病
肠道相关的常见疾病包括炎症性肠病、短肠综合征、肠瘘、结直肠癌和假膜性结肠炎等。
在正常生理稳态条件下，我们的肠道黏膜、免疫系统、肠道微生物、营养物质和代谢产物等相互作用而形成动态平衡状态。肠道微环境紊乱或是内源性病因会打破稳态平衡导致肠道上皮损伤和病变。因此，肠道干细胞必须积极发挥再生和修复的功能，以补充受损丢失的细胞。在这个过程中肠道干细胞需要精准调控增殖和分化之间的平衡。当肠干细胞的自我更新能力失去调控，过度增强，可能会引起干细胞及其子代细胞的生长不受调控限制；另一方面当肠干细胞分化过程受到抑制、或者发生障碍时, 细胞增殖能力也可能会变强。这两种情况都能引起增生性疾病特别是肿瘤疾病，如结肠癌、直肠癌等。
相反，当肠干细胞自我更新能力减弱或发生障碍, 干细胞提前老化无法补充新的干细胞, 导致干细胞数量减少，，从而使组织器官的功能细胞因缺失补充细胞而减少；另一方面如果干细胞分化发生障碍, 也会导致组织器官的功能细胞减少。当功能细胞的形成数量不能满足组织器官的耗损, 最终导致组织器官更新与修复不全, 会引起组织器官衰竭。最近的一项研究，揭示了肠道干细胞中基因组不稳定性会引发干细胞坏死，从而导致自发性的肠道炎症的机制。这项研究提示以肠干细胞坏死为靶点可能是治疗重度炎症性肠病的一种方法。
肠道干细胞作为肠道更新和维持的重要角色，与许多疾病的致病机理密切相关。目前越来越多的研究将肠道疾病与干细胞缺陷联系起来，为我们能更好的理解和治疗肠道疾病提供了更多的维度和可能性。
6 文末结语
一粥一饭，食物为我们提供充足的能量，肠道则是我们吸收营养获得能量的重要器官，也是防御外界病原体感染的守卫者之一，而肠道干细胞维护着肠道的活力。我们身体中的器官就像是精密的仪器一样维持着我们每天的健康状态。
参考资料：
1.de Sousa E Melo F, de Sauvage FJ. Cellular Plasticity in Intestinal Homeostasis and Disease. Cell Stem Cell. 2019;24(1):54.
2.Zhao Q, Guan J, Wang X. Intestinal stem cells and intestinal organoids. J Genet Genomics. 2020;47(6):289.
3.Clevers H. Modeling Development and Disease with Organoids. Cell. 2016;165(7):1586.
4.Tuveson D, Clevers H. Cancer modeling meets human organoid technology. Science. 2019;364(6444):952.
5.Barker N, van Es JH, Kuipers J, et al. Identification of stem cells in small intestine and colon by marker gene Lgr5. Nature. 2007;449(7165):1003.
6.Santos AJM, Lo YH, Mah AT, Kuo CJ. The Intestinal Stem Cell Niche: Homeostasis and Adaptations. Trends Cell Biol. 2018;28(12):1062.
7.张馨文,王海方 & 刘志华.(2016).潘氏细胞在肠道稳态中的作用. 生命科学(02),275.
8.Wang R, Li H, Wu J, et al. Gut stem cell necroptosis by genome instability triggers bowel inflammation. Nature. 2020;580(7803):386.
赵宇煊，清华大学药学院，博士研究生
指导老师：王霞研究员，清华大学药学院，博士生导师，国家重点研发计划干细胞及转化研究专项项目骨干。主要从事成体干细胞和人类疾病的研究工作。课题组掌握多种成体干细胞培养方法，可获得具有长期稳定自我更新能力和精确谱系分化能力的成体干细胞；并掌握独特的气液界面分化技术，构建三维立体的上皮组织类器官。课题组利用这一技术平台构建疾病模型，主要关注成体干细胞病变在结直肠、肝脏、胰腺等相关疾病中的作用。
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谁持彩练当空舞 ：干细胞基础与临床研究进展
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