上期我们介绍了空间转录组冰冻组织样本的制备，那么这期就来聊一聊空间转录组FFPE样本的那些事儿。FFPE样本常用于储存临床上的病理组织，是珍贵的医学研究材料，但由于FFPE样本固定时福尔马林的使用和保存时间久等原因，导致核酸存在不同程度的降解，使得研究基因表达颇为棘手。10x Genomics经过探索推出了Visium FFPE空间基因表达解决方案，不仅突破了这个障碍，能从 FFPE 样本中以高灵敏度和高特异性分析相关基因的表达，而且还能结合空间位置信息，对整张组织切片进行分析，从而真正地实现在形态学背景下的探索性发现。
Visium For FFPE实验原理
Visium FFPE空间基因表达是基于探针杂交的原理，使用的载玻片与之前的冰冻切片空间基因表达解决方案类似，在一张玻片上面包含4个捕获区域，每个区域包含5000个spots，根据组织类型的不同，每个spot约覆盖1-10个细胞，每个spot包含数百万的探针，每个探针上带有spatial barcodes，用来标记空间位置。FFPE解决方案针对靶mRNA设计了两段连续的特异性探针，覆盖人18,000个基因、小鼠20,000个基因，试剂盒中包含有LHS(左端探针)和RHS（右端探针）。左端探针包含有read 2结构，右端探针包含有polyA结构。探针被杂交后，只有靶mRNA的两段连续探针同时被杂交，探针才会进行连接，若只有一段被捕获，后续将无法完成建库，有效降低假阳性。之后mRNA模板彻底降解掉，仅存的探针序列从组织原位中被透化出来，组织透化后，被连接的成对探针与芯片上包含空间barcode、UMI和poly(dT）序列的引物序列捕获，并且空间barcode和UMI序列被延伸到成对探针序列上。最后携带空间barcode的探针序列用于进行测序文库构建和测序。
Visium For FFPE实验流程
1. 将FFPE组织切片放置在Visium基因表达芯片上，进行进行组织学成像（H&E用于形态学背景，IF用于蛋白质共表达检测）；
2. 用RTL探针集在组织中靶向杂交和连接，并用RNase酶处理和透化，然后与芯片上的捕获探针结合延伸；
3. 制备测序文库，获得测序数据后，通过空间条形码将带有条形码的文库映射回捕获区域上的特定数据点；
4. 使用可视化软件，将空间分辨的基因表达数据与组织切片的高分辨率显微镜图像相叠加进行分析和呈现。
Visium For FFPE数据对比
FFPE样本与新鲜组织样本数据对比：
A.对小鼠脑FFPE与新鲜冷冻组织分别进行Visium分析发现，两种组织检测到的基因具有高度相关性，显示了Visium对FFPE样本的可靠性和高灵敏度；
B.Hpca空间mRNA表达数据显示，在新鲜冷冻和FFPE样品的海马中均有该基因表达，与已知的表达模式一致，表明了Visium对FFPE的特异性；
C.对小鼠大脑FFPE样本中连续切片，用Visium FFPE处理后，在聚类和UMIs检测中显示出高重现性。
使用Visium FFPE 空间基因表达解决方案来检测人乳腺癌FFPE样本中约18000个基因：
A.H&E染色图像，覆盖了来自FFPE的WTA数据；
B.总基因；
C.聚类分析；
D.关键乳腺癌基因（ERBB2 (HER2)，孕酮受体(PGR)和雌激素受体(ESR1)）的表达水平和空间组织位置分布。
Visium For FFPE送样要求
样本制备
1. 取材
材料选择时须尽可能不损伤所需要的部分，刀要锐利，动物组织取材建议灌流后取材，冲去过多血液。尽可能割取生活着的组织块，并随即投入固定液。材料应该小而薄，一般厚度不超过2mm，大小不超过6.5×6.5mm2。
2. 固定和水洗
取好的组织块用10%缓冲中性福尔马林（甲醛）液固定24~48h。随后用流水冲洗，大块组织一般冲洗24小时，小块组织一般冲洗2—10小时。
3. 脱水
在有盖瓶中，从30％乙醇开始，经过50％、70％、80％、95％、100％至完全脱水。一般各级乙醇中放置45min到1h。
4. 透明
将组织块先经纯乙醇与二甲苯的等体积混合液，再进入纯二甲苯。透明时间应由组织大小而定，—般各级停留时间在30min至2h，在纯二甲苯中应更换2次，总时间则以不超过3h为宜。
5. 透蜡
须在恒温箱中进行， 恒温箱的温度调节至高于石蜡熔点3度，使经过透明的组织块依次用石蜡与二甲苯的等量混合液、纯石蜡处理。纯石蜡应处理2～3次，透蜡的时间依材料性质而定，一般每次需15～30min。
6. 组织包埋
准备好纸盒，将熔蜡倒入盒内，迅速用预温的镊子夹取组织块平放在纸盒底部，切面朝下，再轻轻提起纸盒，平放在冷水中，待表面石蜡凝固后立即将纸盒按入水中，使其迅速冷却凝固，30min后取出。
样本需求
1. 组织区域大小：< 6.5×6.5mm2，较大的组织将被切除。
组织样本太大的话，可以根据不同病变区域分为多个样本。例如，肿瘤组织可以分为中心/边缘/正常组织进行切片观察。另外，研究三维结构可能要做连续的切片，看三维结构的共性可能要找到不同组织进行连续切片。
2. 切片厚度：5μm。
FFPE样本切片厚度一般为5μm（区别于冰冻组织样本的10μm），切片样本大小不宜超过6.5mm × 6.5mm（载玻片的大小），超出的部分无法被捕获到，反而可能会影响其他样本空间信息。
3. 低温寄送样本（冰袋）。
Visium For FFPE样本质控
1. H&E 染色，观察组织形态是否完整，辅助选定目标区域（6.5mm X 6.5mm范围内）。
2. 石蜡包埋组织提取的RNA，要求DV200≥ 50%。
DV200指的是RNA样本中，长度大于200 nt的RNA分子数量占总分子数量的比例。DV200值越高，表明RNA分子的完整度越高。空间转录组的探针长度是25 25 nt，RNA分子越完整，跟探针结合的几率就越高。如果RNA降解得过短，就会影响探针的捕获效率。
检测样本DV200时，一般切取5-10片切片进行RNA抽提，再使用片段分析仪进行RNA分子长度检测。
上图显示的样本来自DV200<50%（A）和DV200>50%（B和C）
3. 组织黏附试验:确保切片与试片黏附良好。
通过切片脱蜡染色再复水，显微成像观察脱片情况，保证正式实验样本切片能牢固的粘附在玻片上，防止后续实验过程中加各种试剂或洗涤浸水导致切片脱落。
上图从左到右：无脱片、小范围脱片、大范围脱片、完全脱片
更多资讯请关注“云准科技”公众号关于云准ABOUT US云准医药科技（上海）有限公司（以下简称：云准）英文名：AccuraMed，用精准和医药相结合。云准成立于2016年，是一家专注于组织生物学标记物检测分析、肿瘤创新药物靶点发现及临床病理免疫诊疗检测方案开发的高科技公司。针对当前热点的肿瘤免疫相关研究致力于为客户提供先进的肿瘤组织免疫微环境分析解决方案。目前我们公司代理Akoya的产品（PhenoCycler平台和PhenoImager平台），并基于此可以提供肿瘤免疫微环境检测相关技术服务。此外云准科技还可以为您提供单细胞 空间多组学技术服务，全方位解析生命的奥秘。云准科技拥有显微切割平台及Thunder活细胞成像平台，为您提供专业的显微切割和Thunder活细胞成像服务。此外我们公司还有配备了3i显微镜成像系统，可以为您提供Marianas LightSheet 成像技术服务和Cleared Tissue LightSheet组织透明化成像服务。此外我们还引进了Agena核酸质谱进行基因分型的检测服务。未来，云准将以创新为驱动力，继续对产品进行深度整合与开发，推动肿瘤免疫、创新免疫疗法和病理诊断技术的突破性发展，必将为肿瘤的诊断和治疗带来革命性变化。
