做实验的小伙伴们都知道,与DNA相比,RNA是极其脆弱的。这是由于RNA自身的不稳定性及RNase的稳定存在,极易被分解。一旦降解,后续实验结果往往不如人意。因此,提取RNA后,我们需要对RNA进行相关的质量检测,来确定它是否符合后续的实验要求,如qPCR、Northern分析、cDNA文库构建以及用于微阵列芯片分析的cDNA标记实验等。
浓度(纯度)检测
RNA得率有很强的组织特异性,不同组织RNA的丰度和RNA提取的难易程度共同决定了该种组织的RNA得率。那闲话少说,我们来看看下面两种测定RNA浓度的方法。
01、紫外分光光度计
核酸分子的嘌呤和嘧啶碱基,都具有共轭双键,其能吸收紫外光并在260 nm处具有最大吸收峰。大多数蛋白质含有芳香族氨基酸,这些氨基酸在280 nm处有最大吸收峰。另外一些盐离子和有机化合物在230 nm处有吸收峰。
图1.各物质紫外吸收波长
根据这些理化性质,可以用紫外分光光度计的方法检测核酸浓度。通常以OD260为1相当于40 ng/μL的单链RNA,因此RNA样品浓度(ng/μL)=OD260×稀释倍数×40 ng/μl。
注意:测量时需先使用溶解RNA的溶液对紫外分光光度计进行校正。
除了RNA浓度,OD260/280和OD260/230还能指示RNA的纯度:
注意:溶液pH值会影响OD值的测量,若用纯水溶解,溶液呈弱酸性,导致OD280上升,OD260/280偏低。
02、荧光染料法(Qubit计)
荧光染料可特异的与靶分子(双链DNA、单链DNA、RNA或蛋白)结合,在特定波长光源的激发下发出荧光,仪器接收荧光值转化为浓度值,从而对DNA和RNA进行精准定量。
图2. Qubit检测实验流程
03、两种浓度检测方法比较
紫外分光光度计和荧光染料法检测各有优势,建议配合使用。紫外分光光度计能指示核酸纯度;荧光染料法特异性及灵敏度更高,适于精确定量的下游实验以及低浓度的珍贵样本,如二代测序等。
完整度检测
01、琼脂糖凝胶电泳
我们检测总RNA完整性最常用的方法是采用琼脂糖凝胶电泳。RNA电泳可以在变性和非变性两种情况下进行。在非变性条件下,无法准确判断其分子量;在变性条件下,排除二级结构的影响,RNA的泳动速率与分子量的对数呈线性关系。因此,如需精确测定RNA分子量,需使用变性凝胶,但若为了快速检测RNA完整性,使用普通的琼脂糖凝胶即可。
在看电泳图前,我们需要了解一下沉降系数(S),它是反映生物大分子在离心场中沉降速度的一个指标,值越高,说明分子越大。
图3.RNA质量较好的电泳图示例(肝脏)
那好的电泳图具有哪些特征呢?(如图3)
(1)从上到下呈现3条rRNA条带,且上面两条条带明亮、清晰、锐利(指条带的边缘清晰):
★ 一般动物样品有28S、18S、5S——如果提取过程经过过柱处理或者利用CTAB LiCl方法提取,5S可能较暗或者没有。若是昆虫或软体动物等样本,则只有1条比较明显的带,例如果蝇、牡蛎等。
★ 一般植物样本有三条带:25S、18S、5S;
★ 原核生物一般为:23S、16S、5S;
理论上28S:18S为2.7:1,但长期以来人们使用2:1的比率作为鉴定完整RNA的标准。事实上,大多数样品中提取的RNA几乎都达不到2:1的比值。以DNA Marker做对照(如图3),如果2 kb处的28S和0.9 kb处的18S条带清晰,且28S:18S>1,该完整性可以满足绝大部分实验的要求了。
(2)无多余条带。杂带有两种可能:一是存在DNA污染(图4),二是组织部位本身含条带较多(例如含大量叶绿体的样本,如植物叶片等)
图4. DNA污染
02、2100检测
Agilent 2100检测可通过芯片实验室微流控技术平台同时对RNA的完整性、纯度或降解程度进行精确的、数字化的评估,可以替代传统的凝胶分析方法。其以峰图和RIN值(RNA Integrity Number)来指示RNA的完整性。
▶ 2100峰图:
若核酸完整,则峰图基线平整;若核酸降解严重,则基线不平并出现较多降解峰。
▶ RIN值:
数值大小即反映RNA的完整性,在0-10区间范围内,数值越大表明RNA质量越好、完整度越高。且RIN值越大,基线越平整、主峰越锐利。一般认为RIN值≥5,说明RNA完整度较为良好,RIN值≥8,说明RNA完整度较为完美。
下图为典型的真核生物2100检测峰图:
图5.真核生物2100峰图(HEK293)
典型真核生物2100峰图中常见有5个峰(图5),但不是所有真核生物都是这几个峰。如植物叶片的细胞器也含有核糖体,在18S前的3个小峰为叶绿体RNA(图6)。
图6.水稻叶片峰图
(改自:谢月兰, 等. 中国农学通报, 2020)
细节决定后续实验结果的好坏!掌握RNA检测方法,让我们的实验轻松上手!
,