创伤后应激障碍(post-traumaticstressdisorder，PTSD)是个体在遭遇重大创伤事件之后所产生的一种以恐惧记忆的闪回、噩梦和高警觉状态为主要症状的精神疾病。促进恐惧记忆的消退是治疗PTSD的有效途径之一。暴露疗法以条件性恐惧消退范式为基础，在临床PTSD患者的治疗中取得了良好效果。
条件恐惧记忆的建立和消退过程都高度依赖于创伤产生的情景，海马是进行情景信息加工的重要脑区。研究表明在恐惧记忆的建立和消退过程伴随着海马神经元树突棘的动态重塑。恐惧消退可以逆转由于条件性恐惧建立导致的树突棘的增加。然而调节机制尚待阐明。
瞬时受体电位阳离子通道(transientreceptorpotentialcanonical，TRPC)是TRP(transientreceptorpotential)基因超家族下的一个亚家族，主要包括TRPC1、TRPC2、TRPC3/6/7和TRPC4/5。由于大脑中与工作记忆有关的区域表现出持续的放电现象，而TRPC通道支持单个神经元的持续放电，且改善工作记忆的神经调质受体往往也会激活TRPC通道，所以TRPC通道被认为是构成工作记忆的基础之一，许多研究都报道了其亚型在学习记忆中的相关作用。例如NEUNER等的研究表明，干扰小鼠海马TRPC3蛋白的表达可以提高小鼠在情景恐惧记忆范式测试阶段的僵直行为百分比。TRPC6与TRPC3具有较高的序列相似性，且二者都可以被BDNF激活。
TRPC6编码钙可通透的非选择性阳离子通道，主要位于海马神经元的树突棘部位。已有研究表明其可以正向调控海马神经元钙离子内流并引起树突棘的形成，进而增强空间学习记忆能力，提示TRPC6对依赖于海马的突触结构和记忆具有重要作用。然而TRPC6是否参与条件性恐惧记忆的建立和消退目前尚不清楚。因此，本研究采用腺相关病毒介导的RNA干扰抑制海马TRPC6的表达，探讨TRPC6在情景条件恐惧记忆建立和恐惧消退中的作用，旨在为治疗PTSD提供实验依据。
1材料与方法1.1材料
1.1.1实验动物
SPF级雄性成年(6～8周)C57BL/6J小鼠，体质量(22±2)g，购自陆军军医大学实验动物中心，由动物房专人饲养，光/暗周期为12h/12h，自由觅食和饮水。操作均符合陆军军医大学关于实验动物使用的管理和伦理规定。
图片仅为插图，不作参考
1.1.2主要仪器和试剂
SuperMaze动物行为视频分析系统(XR-Xmaze，上海欣软信息科技有限公司);旷场实验分析系统(XR-XZ301，上海欣软信息科技有限公司);高架十字迷宫分析系统(XR-XG201，上海欣软信息科技有限公司);SuperFcs条件性恐惧实验系统(XR-XC404，上海欣软信息科技有限公司);TRPC6抑制腺相关病毒(AAV，干扰靶点序列为:5'-TCGAG-GACCAGCATACATG-3')及对照腺相关病毒(和元生物技术有限公司);兔抗TRPC6(编号ACC-017，美国AlomoneLab公司);小鼠抗β-actin(编号AA128，上海碧云天生物有限公司)。
1.2方法
1.2.1实验分组
使用随机数字表法将32只小鼠分为条件恐惧组和恐惧消退组，每组16只。条件恐惧组(立体定位注射后21d进行条件恐惧的建立，22d进行恐惧记忆的测试)分为空病毒对照组(Control)和病毒干扰组(sh-TRPC6)，每组8只;恐惧消退组(立体定位注射后4d进行条件恐惧的建立，21d进行条件恐惧消退训练，22d进行消退记忆的测试)分为空病毒对照组(Control)和病毒干扰组(sh-TRPC6)，每组8只。
1.2.2动物模型建立
在行为学实验前24h将小鼠移至行为学实验室内，以使其适应实验室环境。情景性条件恐惧的建立参考HAIT等的方法:将小鼠放入条件恐惧箱，适应150s后，给予5次不可逃避的足底电击(0.7mA，2s)，每次电击间隔58s，记录适应期和每次间隔期内的僵直行为百分比(Freezing%)。情景性条件恐惧消退训练参考NAGAYOSHI等的方法:将小鼠放回条件恐惧箱，不施加任何刺激，进行30min(共6试次，5min/试次)的恐惧消退，记录每个试次内的僵直行为百分比(Freezing%)。以上实验数据由SuperFcs条件性恐惧实验系统记录并自动分析，小鼠僵直行为百分比超过50%即为建模成功。每只小鼠在实验结束后送回动物房，并用75%酒精清除试验箱内残留气味。
1.2.3立体定位注射
腹腔注射4%水合氯醛麻醉小鼠后，将其固定在小鼠脑立体定位仪上，充分暴露颅骨表面，以前囟点为零点，使用我们之前已经验证过的坐标(AP:－1.8mm，ML: /－1.5mm，DV:－1.7mm)对小鼠两侧海马CA1区分别进行病毒注射，病毒滴度2.5×1012V.G./mL，每侧注射0.9μL，注射速率0.2μL/min。对照组注射GFP标记的空病毒(Control)，干扰组注射TRPC6的shRNA病毒(sh-TRPC6)，注射完成后留针5min再缓慢退针。
1.2.4AAV-TRPC6转染位置的鉴定
腺相关病毒注射20d，取小鼠海马切片经PBS漂洗后用5%羊血清工作液室温孵育30min，DAPI染核5min，PBS漂洗3次后封片，用激光共聚焦显微镜(Leica，Germany)观察CA1区荧光表达并采集图像。
1.2.5Westernblot检测
深度麻醉小鼠后快速断头取脑，冰上分离海马组织。1%PMSF(碧云天生物科技)及RIPA(碧云天生物科技)处理。BCA蛋白浓度测定试剂盒(碧云天生物科技)测定蛋白浓度。SDS-PAGE电泳后转膜至PVDF膜上。室温下5%脱脂奶TBST抗原封闭2h，加入特异性一抗TRPC6(1∶500)，4℃过夜。加入辣根酶标记山羊抗兔IgG(1∶2000，中杉金桥公司)37℃孵育1.5h后，ECL显色。Image-ProPlus6.0软件对目的条带的相对灰度值进行量化分析。
1.2.6旷场实验
旷场试验箱为50cm×50cm×30cm医用有机板材制成的无盖盒状箱。将小鼠放入试验箱中心区域，允许其自由探索5min。由配套的摄像头和系统记录并分析运动轨迹，计算其总移动距离(cm)和外周/中心活动度。
旷场实验，XR-XZ301，上海欣软
1.2.7高架十字迷宫
高架十字迷宫实验被广泛用于啮齿动物焦虑水平的检测，动物在开臂中停留时间的百分比和进入开臂的次数与焦虑程度呈负相关。旷场实验用于动物自发活动情况的检测。高架十字迷宫由2个开臂(35cm×5cm×15cm)、2个闭臂(35cm×5cm×15cm)和中心区域(5cm×5cm)组成。将小鼠放入高架十字迷宫中心区域，允许其自由探索5min，由配套的摄像头和系统记录并分析运动轨迹，计算开放臂滞留时间占总时间百分比(%)和进出各臂次数总和。
高架十字迷宫，XR-XG201，上海欣软
1.3统计学分析
计量资料以x珋±s表示，使用SPSS22.0统计分析。对于条件恐惧建立和消退过程中的Freezing%变化趋势，使用重复测量方差分析，其余检测指标均采用独立样本t检验，以P＜0.05为差异具有统计学意义。
文章来源于第三军医大学田益沁、陈秀秀等老师发表的《TRPC6 在小鼠情景性条件恐惧记忆建立和消退中的作用》，分享于众欢迎品尝~
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