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*本文首发于“纳米酶Nanozymes”公众号，2021年12月26日
*编辑：俞纪元
动脉粥样硬化是大多数心血管疾病(CVD)，如急性心肌梗死(AMI)和中风的主要原因，是世界范围内主要的死亡原因[1]，[2]，[3]。动脉粥样硬化的进展与脂质和泡沫细胞在动脉壁的积累密切相关，这些细胞可以加速血小板堆积。当内皮细胞大量吸收氧化低密度脂蛋白(oxLDL)时，脂质积累迅速增加，诱导分化为泡沫细胞。随着大量泡沫细胞的出现，动脉血管[4]，[5]，[6]的内皮层开始出现动脉粥样硬化斑块。不幸的是，血小板可以堆积在动脉粥样硬化斑块破裂的部位，同时释放促炎介质与其他相关细胞[7]相互作用。因此，抑制泡沫细胞形成和抗血小板积累已成为预防和治疗动脉粥样硬化[8]，[9]，[10]的关键策略。
为此，山东大学微生物技术研究院微生物国家重点实验室赵康课题组和天津大学药物科学与技术学院李楠课题组联合设计了一种负载替格瑞洛和聚乙二醇化的树莓状铂(Pt)和铈(Ce)双金属纳米结构(PtCe NRs) (DSPE-PEG2000-ticagrelor-PtCe NRs, DPTP NRs)，通过协同泡沫细胞抑制和抗血小板聚集来减弱斑块，用于动脉粥样硬化治疗。一方面，高表面粗糙度和树莓状结构面积赋予双金属材料增强活性氧(ROS)清除活性，减少斑块中氧化低密度脂蛋白的产生，从而抑制泡沫细胞的形成。另一方面，替格瑞洛可对P2Y12受体进行非竞争性抑制，激活P2Y12-ADCY-CAMP/p-VASP通路，抑制血小板大规模聚集，防止斑块进一步扩张。
该工作以“Platinum-cerium bimetallic nano-raspberry for atheROSclerosis treatment via synergistic foam cell inhibition and P2Y12 targeted antiplatelet aggregation”为题发表在Chemical Engineering Journal上。
纳米成分和动脉粥样硬化治疗机制示意图。
铂铈双金属纳米树莓通过协同抑制泡沫细胞产生和P2Y12靶向抗血小板聚集治疗动脉粥样硬化。
图1纳米酶材料的物象表征。
如图1所示的结果，研究者通过利用油胺(OLA)热注入金属前体合成了PtCe NRs。在此合成中，OLA在高温下作为还原剂。同时，OLA的长脂肪链提供的疏水效应在晶格生长过程中起到了保护和稳定作用。在两前驱体均匀化过程中，Pt首先被还原为框架状的纳米晶，而在120℃下Ce逐步诱导生长到结构的多边形表面，形成富Ce面。在这种情况下，由于体系中特定元素的分离，两种金属材料最终生长为双金属纳米合金。按照以下步骤，通过与EDC和NHS的配体交换，对表面为OLA疏水端的PtCe纳米结构进行半胱氨酸(Cys)和DSPE-PEG2000-NH2修饰。最后，通过范德华力和有机大分子吸附将分子替格瑞洛负载到PtCe NRs的有机层中。
图2.纳米酶材料SOD和CAT酶的活性以及小分子药物替格瑞洛的负载和释放性质探究。
结果表明，在DPTP NRs下能明显观察到ESR三重谱峰，证明了SOD和CAT活性的存在，与可能的氧空位的形成。在这种情况下，更多的氧分子被困在空位中，导致氧应力衰减。所有这些结果表明，DPTP NRs可以加速ROS清除和调节氧化应激，因此在心脏治疗中具有显著的潜力。
图3.评估纳米酶在细胞水平上超氧阴离子等自由基的清除能力，以及油红O (ORO)染色试验考察纳米酶对泡沫细胞的形成的抑制能力。
在动脉粥样硬化斑块炎症表达高的区域会导致氧化应激发生，产生过量的ROS，从而超过内源性抗氧化能力。因此，我们进一步研究DPTP NRs在体外是否能调控ROS水平。本节选取LPS刺激的HUVEC细胞作为模型组，单独用新鲜培养基培养的HUVEC细胞作为对照组。选择2'，7' -二氯二氢荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)作为荧光探针，以反映细胞内总ROS水平。从结果可以看出，与模型组相比，实验组DCFH-DA的细胞内绿色荧光信号明显下降。特别是DPTP NRs治疗组(V、VI组)，降低近50%(图3C)。受此启发，我们采用ROS Green TM H2O2和DHE (dihydroethidium, DHE)探针在细胞水平检测DPTP NRs对过氧化氢和超氧阴离子的清除能力。与上述结果一致，与模型组相比，实验组的绿色(H2O2)和红色荧光信号(O2•−)明显减弱。
随后，我们研究了DPTP NRs治疗是否能通过减弱oxLDL的内化而有效抑制泡沫细胞的形成。与之前的研究一致，oxLDL处理RAW264.7巨噬细胞24小时，显示出大量的细胞内脂滴和显著的巨噬细胞泡沫形成，如油红O (ORO)染色(OD 518 nm)所示。然而，与对照组（100±4.2）相比，DPTP NRs治疗组（65.1±0.72）在RAW264.7巨噬细胞和HUVEC细胞系中分别观察到明显抑制效果。由此可见，DPTP NRs可以介导氧化低密度脂蛋白刺激的泡沫细胞抑制。
图4.动脉粥样硬化预防性治疗实验方案示意图和病理结果分析。
根据上述研究结果，作者采用转脂蛋白敲除ApoE−/−小鼠在摄入高脂饮食，建立动脉粥样硬化动物模型，并在高脂饮食1个月后进行约2个月的预防治疗。按照预防治疗策略安排，高脂饮食1个月后，将实验动物编组为(Ⅰ)对照组(C57BL/6小鼠)、(Ⅱ)模型组(ApoE−/−小鼠生理盐水治疗)、(III)替格瑞洛(ApoE−/−小鼠)、(IV) DPTP NRs(ApoE−/−小鼠低剂量，100 mg kg-1)治疗组、(Ⅴ)DPTP NRs(ApoE−/−小鼠高剂量, 150 mg kg−1)，并与高脂肪饮食结合。然后采集离体主动脉组织样本进行分析。在这种情况下，与模型小鼠相比，治疗小鼠可以清楚地显示出抗动脉粥样硬化纳米疗法的治疗效果。结果显示，生理盐水处理组(模型)ORO阳性区最高，而对照组ORO染色区最低(图4B)。替格瑞洛和DPTP NRs治疗组主动脉ORO阳性区较模型组明显减少。值得注意的是，大剂量DPTP NRs治疗小鼠主动脉的ORO染色病变明显降低。定量结果显示，对照组(C57BL/6小鼠)、模型(生理盐水)、替格瑞洛、低剂量DPTP NRs和高剂量DPTP NRs的平均斑块面积分别为9.1±1.3、28.4±4.8、24.2±1.9、15.6±2.8和12.5±2.5%(图4C)。与这些结果一致的是，各组主动脉根的ORO染色切片也显示了DPTP NRs在低剂量和高剂量下的抗动脉粥样硬化能力(图4E)。此外，苏木素/伊红(H&E)染色主动脉根切片显示斑块主要由脱细胞、富含脂质的坏死核心组成(图4D)，DPTP NRs处理小鼠的坏死核心与模型组相比明显减少.
综上所述，我们研究了动脉粥样硬化的炎症和血小板凝集问题，通过开发一种稳定的、静脉注射的负载替格瑞洛和加入DSPE-PEG2000的PtCe双金属树莓状纳米颗粒(DSPE-PEG2000-ticagrelor-PtCe NRs, DPTP NRs)。所制备的DPTP NRs纳米系统具有多方面的独特特性，包括：1)能够分解内源性H2O2，快速减弱活体环境中的H2O2水平；2)DPTP NRs表面粗糙，以及结合DSPE-PEG2000的捕获能力，可以提高替格瑞洛的装载效率，在生物运输过程中稳定其活性，且不提前释放；3)Ce和Pt双金属纳米合金可整体放大SOD，降低超氧阴离子水平，导致oxLDL降低，抑制泡沫细胞的形成；4)考虑g蛋白偶联的P2Y12受体作为血小板激活和聚集的中央介质，选择P2Y12受体拮抗剂替格瑞洛作为血小板聚集减弱的负载物，结合泡沫细胞抑制策略，从而削弱斑块的发生以及抑制动脉粥样硬化的发展，本实验在动脉粥样硬化治疗以及抑制高危并发症方面发挥一定的潜在作用。
参考文献
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撰稿：王思宇
审阅：程超群
编辑：俞纪元
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