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(一)制备菌悬液

在食用菌诱变育种中,一般选择单核孢子进行诱变处理。如果菌丝细胞内含有2个以上的核,由于基因突变具有随机性和独立性,各个细胞核不可能同时发生相同的基因突变,在其后代中就会出现不一致的菌落,且细胞核之间可能存在相互作用,影响突变性状的稳定,一般都不选择单核菌丝或双核菌丝作为诱变材料。

食用菌栽培准备(食用菌诱变育种具体操作方法可以分为哪几步)(1)

木碗蘑菇

在诱变处理食用菌单核孢子时,最好使单细胞的孢子处于悬浮状态,均匀分布在悬浮液中。采用物理诱变时,一般用生理盐水配制悬浮液即可。如果采用化学诱变剂进行处理,考虑到诱变剂可能引起pH改变,从而产生各种不同的效应,通常须使用缓冲液配制孢子悬浮液。食用菌孢子悬浮液的浓度应控制在105个/L左右,悬浮液中孢子数可用平皿稀释计数法、光吸收法或血细胞计数板进行测定,最好先测定孢子中的活孢子数。可以同时测定不同浓度的孢子悬浮液的细胞数和光吸收值,制定标准曲线,以后只测定光吸收值,就可从标准曲线上查出活孢子数。

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在托盘上的新鲜白蘑菇 (牛肝菌)

(二)诱变方法的选择

在物理诱变中,使用紫外光诱变成本低廉,对人体损害较小,诱变效果也较好,是最常用的物理诱变方法之一。常用化学诱变剂分为2类:一类是烷化剂,常用烷化剂有甲基磺酸乙酯、亚硝基胍、乙基磺酸乙酯和芥子气等;另一类是碱基类似物,常用碱基类似物有5-溴尿嘧啶和2-氨基嘌呤。对不同的食用菌诱变材料而言,最合适的诱变剂和诱变条件不同,同一诱变剂对不同食用菌材料的诱变效应也不一样。一般而言,对同一个菌株采用不同的诱变剂进行多次诱变处理,诱变效果好于使用同一种诱变剂进行多次诱变处理。

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食用菌栽培

(三)诱变处理的过程

杀菌率常用来表示各种诱变剂的相对剂量。诱变既可能产生正向突变,使食用菌产量、品质等性状得到改善,也可能产生负向突变。适宜的剂量应该是在确保产生高诱变率的基础上,尽可能促使变异向正向突变范围移动,这需要经过多次试验进行反复摸索。近年来对紫外光、X射线和乙烯亚胺等诱变效应的研究发现,使用偏低的剂量时正向突变较多地出现,使用偏高的剂量时负向突变较多地出现。在进行紫外线诱变时,常采用杀菌率高达99.9%99.9%的剂量,近年来倾向于采用杀菌率为70%~75%的剂量,甚至更低的剂量。

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种植的蘑菇

1.物理诱变物理诱变通常在专门的设备上进行操作,研究人员只需将准备好的样品交给操作人员,并提出需要的照射剂量即可。一般在暗室的诱变箱或接种箱中安装15W紫外灯管,诱变前先打开紫外灯预热20min,使光波稳定。将10~12mL孢子悬浮液移入直径9cm的培养皿中,打开培养皿盖,将孢子悬浮液置于紫外灯管下方30cm处,照射时间为0.5~5min。将照射处理后的孢子悬浮液稀释后涂平板,或加入培养基增殖培养后再涂平板,但增殖培养时必须用黑纸包住培养器皿。整个诱变操作过程须在红光下进行,孢子萌发培养时也应注意避光。

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器皿里的食用菌

2.化学诱变化学诱变剂处理后,必须及时终止反应。可以用大量稀释的方法终止诱变剂的作用,也可用解毒剂来终止。例如采用甘氨酸解除氮芥的作用,采用硫代硫酸钠终止硫酸二乙酯的作用,也可以采用提高pH来终止亚硝酸等酸性诱变剂的作用。采用甲基磺酸乙酯诱变处理食用菌孢子时,常用浓度为0.1~0.4molL。先将食用菌孢子悬浮在0.1mol/LpH7.0的磷酸盐缓冲液中,孢子浓度10个/mL;再取9mL孢子悬浮液,加入浓度为1.5moL的甲基磺酸乙酯溶液1mL,摇匀后静置保温3~6h,也可适当延长或缩短时间。最后进行离心、洗涤,稀释,涂平皿,或加入培养基培养过夜后,再涂平板,从长出的菌落中逐步筛选优良突变子。

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白色的夏天牛肝菌

(四)挑选突变株

孢子经诱变和培养长出菌落之后,及时挑出单个菌落,进行突变体筛选。对于同宗结合真菌的担孢子,可以将挑出的单个菌落移至试管斜面上,直接进行农艺性状考察。于诱变材料是单核孢子,异宗结合真菌的担孢子萌发的菌丝体通常都是同核体。对于异宗结合真菌而言,诱变获得的单核体菌株只能作为杂交育种的材料,需要首先考察诱变的单核体菌株是否具有遗传性状变异,然后再将突变的单核体菌丝与可亲和的单核体菌丝进行杂交。对于诱变获得的单核体及其杂交获得的杂交子,都必须进行培养特性、农艺性状和商品性状考察,挑选优良的突变株材料或杂交子。待杂交子产生子实体或组织体之后,进行组织分离获得纯培养菌株,并经过多次栽培试验和示范,获得遗传稳定的突变体菌株。

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