在做western blot之前，我们收集的组织、细胞等样品可能很珍贵，抛弃不同大小的蛋白要耗费很多样品，所以一般我们要进行蛋白定量，一般我们使用BCA定量试剂盒，市面上有很多Commercial试剂盒，效果都不错。但是如何又快又准定量蛋白，这里还是有点小窍门的，今天，医学方小编就给大家分享一下BCA蛋白定量的技巧。
一、实验原理
首先，我们先了解下BCA蛋白定量的原理。BCA蛋白浓度检测是根据吸光值可以推算出蛋白浓度。碱性条件下，蛋白将Cu2 还原为Cu ， Cu 与BCA试剂形成紫颜色的络合物，测定其在562nm处的吸收值，并与标准曲线对比，即可计算待测蛋白的浓度。
BCA法测定蛋白浓度不受绝大部分样品中的化学物质的影响，可以兼容样品中SDS， Triton X-100， Tween20、60、80。但一般受螯合剂EDTA和略高浓度的还原剂的影响，需确保EDTA低于10mM，二硫苏糖醇(DTT)低于1mM，β-巯基乙醇(β-Mercaptoethanol)低于0.01%。不适用BCA法时建议使用Bradford蛋白浓度测定。BCA操作简单，快速，45分钟内完成测定，准确灵敏，试剂稳定性好，BCA试剂的蛋白质测定范围是20-200μg/ml，微量BCA测定范围可在0.5-10μg/ml。经济实用，除试管外，测定可在微板孔中就进行，大大节约样品和试剂用量；抗试剂干扰能力比较强，如去垢剂，尿素等均无影响。
二、实验器材
（1）可测562nm吸光度的96孔板酶标仪 ，透明底96孔板（2）恒温箱
（3）天能VE586（4） 若干15ml离心管，1.5ml EP管 （5） 枪式移液管
三、实验步骤
一般BCA定量试剂盒由试剂A，B和BSA组成
1. 试剂准备：
根据样品数计算出所需要BCA工作液的总体积，一般96孔板，每个样品大于等于2复孔，标准曲线大于等于五个点即可。
BCA工作液的总体积=（标准曲线点数 样品数）*重复次数*200ul BCA工作液体积
2. 根据算出BCA工作液的总体积，取体积比为 试剂A：试剂B=50:1，混匀，制成BCA工作液。
3. 制作标准曲线样品，不同人有不同方法，这里，小编的方法是倍比稀释法，以下为两复孔为例。配置2mg/ml BSA, 准备5个1.5ml EP管，标记1-5号，加入50 ul的1*PBS。取2mg/ml 100ul，分别依次加入50 ul EP管中倍比稀释，5号管只是50ul 1*PBS使得五个EP管中最终BSA浓度为2 ug/ml, 1 ug/ml, 0.5 ug/ml, 0.25 ug/ml, 0.125 ug/ml，0 ug/ml， 混匀，加入96孔板每孔20ul，2复孔。
4． 待测样品吸取10 ul 40 ul 1*PBS稀释五倍而成，96孔板每孔20ul，2复孔。
5. 每孔加入200ul 制备好的BCA工作液，将96孔板放置在60℃恒温箱 30min。
6. 稍微冷却后，拿去板盖，放入酶标仪上测出每孔A562值，就是样品在562nm处的吸光度。
7. 计算所有两个孔稀释液A562的平均值。
8. 以BSA标准样品对应蛋白浓度为横坐标x，以相应A562平均值为纵坐标y， 在Excel中拟合标准曲线，得到二元一次方程式y=ax b，R2越接近1最好，小数点后起码两个9。
9. 将样品的A562代入y=ax b方程即可算出样品的浓度，我们样品稀释五倍，最后浓度乘以5即可。
10.VE-586 转移电泳槽是用来对少量核酸及蛋白质样品进行转移电泳的装置。专用开启式转移胶架，操作简便。配备两块槽内蓝冰盒，可提前预冷置于槽内，在转移电泳过程中起降温作用，冰盒可反复使用，方便环保。创新设计，同时可以转印四块凝胶，做到一槽多用，可节省实验空间和经费。
性能特点
槽体采用高强度和高透明度的聚碳酸酯材料注塑成型，免除液体渗漏的困扰。
多重安全设计，免除了可能产生的操作安全问题。
安全按钮式的开盖设计，方便电泳槽盖的开启。
专用开启式转移胶架，操作方便。
可同时转印四块9×9cm凝胶
专用蓝冰盒可反复使用，方便环保。
转印时间为15-60min，也可选择低电压过夜。
可以与VE-680微型垂直电泳槽配套使用
流行外型设计，精品理念，超越国外同类产品同样水平。
四、注意事项
（1）试剂A, B液一般在4℃保存，用前先摇匀，放置久了会有沉淀。
（2）BCA工作液一定要现用现配。
（3）样品要稀释或浓缩到标准曲线范围之内，太稀太浓是没有什么意义的。
（4）BCA法非常容易受到高浓度还原剂的影响，制备样品时候要排除DTT，β-巯基乙醇对于蛋白定量影响。
好了，今天小编教给大家如何快准狠定量蛋白样品，让你不再浪费宝贵的样品，在接下去的实验游刃有余，例如Western blot实验。
,
