最近科学家利用低温电子显微镜的分子成像技术生成了迄今为止最清晰的蛋白图像，并且第一次识别出了蛋白质中的单个原子。研究人员通过使用低温电子显微镜((cryo-EM)实现原子分辨率，将能够前所未有地了解蛋白质的工作原理，这是其他成像技术(如x射线晶体学)无法检测到的。上个月底两个实验室报告的这一突破巩固了低温电子显微镜作为绘制蛋白质三维结构最主要工具的地位。这些精细的蛋白结构将帮助研究人员了解蛋白质如何在健康和疾病中发挥作用，从而开发出副作用更少的药物。
apoferritin蛋白的低温电镜图。资料来源:Paul Emsley/MRC分子生物学实验室
德国哥廷根马克斯·普朗克生物物理化学研究所的生物化学家和电子显微镜专家霍尔格·斯塔克领导了其中一项研究，他说：“这确实是一个里程碑，这是肯定的。真的没有什么可以打破的了。这是最后一个分辨率障碍”。另外两项研究由Sjors Scheres和Radu Aricescu领导，他们是位于英国剑桥的分子生物学医学研究委员会实验室(MRC-LMB)的结构生物学家。这两篇文章都是在5月22日发布在bioRxiv预印版服务器上的。“原子分辨率是一个真正的里程碑”，加拿大多伦多大学的结构生物学家John Rubinstein补充道，获得蛋白质的原子分辨率结构仍然是一项艰巨的任务，因为还有其他的挑战，例如蛋白质结构灵活性。
低温电子显微镜是一种有几十年历史的技术，它通过向样品发射电子并记录产生的图像来确定快速冷冻样品的形状。检测反射电子的技术和图像分析软件的进步催生了一场始于2013年左右的分辨率革命。这使得蛋白质结构比以往任何时候都更清晰，几乎和x射线晶体学所得到的一样好。x射线晶体学是一种更古老的技术，它通过x射线轰击蛋白质晶体时所产生的衍射图样来推断其结构。随后的硬件和软件的进步使得cryo-EM在结构分辨率上得到了很大改善。但是，科学家们不得不在很大程度上依赖于x射线晶体学来获得原子分辨率的结构。然而，研究人员可能要花几个月到几年的时间才能使一种蛋白质结晶，而且许多医学上重要的蛋白质不会形成可用的晶体，相比之下，低温电子显微镜只需要蛋白质在纯化的溶液中就可以了。
电子显微镜的分辨率逐年提高
原子水平的精确图像足以明确辨别单个原子在蛋白质中的位置，分辨率约为1.2埃。这些结构对了解酶的工作原理至关重要，因为可以进一步通过其工作原理来开发药物。为了将cryo-EM的分辨率提升到原子分辨率，这两个团队研究了一种叫做去铁铁蛋白（apoferritin）。由于其稳定性，该蛋白质已成为低温电子显微镜的测试平台。该蛋白质的结构分辨率为1.54埃。
真正的原子分辨率:以1.25埃的分辨率显示apoferritin蛋白单个原子和氢原子
然后，研究小组利用技术改进，拍摄了更清晰的apoferritin照片。斯塔克的研究小组得到了这种蛋白质1.25埃的结构，这得益于一种仪器，它可以确保电子在撞击样本前以相似的速度移动，从而提高了最终图像的分辨率。Scheres和Aricescu团队使用了一种不同的技术来发射以相似速度运动的电子。他们还受益于一种技术，这种技术可以减少一些电子从蛋白质样本中逃逸后产生的噪音，以及一种更灵敏的电子检测摄像头。1.2埃的蛋白结构非常完整，可以在蛋白质和周围的水分子中找到单个的氢原子。斯塔克认为，将这些技术融合在一起可以将分辨率提高到1埃左右，但不会提高太多。对于低温电子显微镜来说，低于1.0埃几乎是不可能的。
新的低温电子成像技术
Scheres和Aricescu也测试一种叫做GABAA受体蛋白。这种蛋白质位于神经元的细胞膜上，是全身麻醉、抗焦虑药物和许多其他药物的靶点。去年，Aricescu的团队使用低温电子显微镜将这种蛋白质定位到2.5埃。但有了新的试剂盒，研究人员获得了1.7埃的分辨率，在蛋白质的一些关键部分甚至有更好的分辨率。Aricescu说:“这就像把你眼睛上的一层阴影去掉一样，在这个分辨率下，每半埃就相当于打开一个宇宙。这个结构揭示了蛋白质中从未见过的细节，包括分子口袋中的水分子，其中有一种叫做组胺的化学物质。原子分辨率的GABAA蛋白不像apoferritin那样稳定，这将是一个挑战。尤其是蛋白质样品的制备方法，可能会为GABAA和其他生物医学上重要的蛋白质的原子分辨率结构铺平道路。蛋白质溶液被冷冻在由黄金制成的小格子上，这些格子的改变可以使蛋白质保持静止。
样品制备是研究更多不稳定蛋白质的主要挑战。在一段时间内，只有获得高质量样品才能获得低于1.5埃，甚至低于2埃的分辨率。这些突破可能会巩固超低温电子显微镜作为大多数结构研究的首选工具的地位。那些觊觎原子结构的制药公司可能更倾向于使用低温电子显微镜。不过x射线晶体学仍有吸引力。如果一种蛋白质可以结晶，就能在很短的时间内产生相对高效的结构，并与成千上万种潜在的药物结合。
参考资料：
https://www.nature.com/articles/d41586-020-01658-1
https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2020.05.21.106740v1
https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2020.05.22.110189v1.full.pdf
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