无精症是导致男性不育的重要因素，约占男性总人口的1%。在严重无精症患者的睾丸和附睾内通常无法获取成熟精子或长形精子细胞，因此这部分患者无法通过体外受精（In vitro fertilization, IVF）或卵胞浆内单精子注射技术（Intracytoplasmic sperm injection, ICSI）获得其生物学后代。尽管如此，在部分无精症患者的睾丸中尚能观察到圆形精子细胞，圆形精子注射（Round spermatid injection, ROSI）技术能够为这部分患者带来福音。著名科学家Ryuzo Yanagimachi于1993年建立了ROSI技术【1】，并利用该技术获得了健康的可育小鼠【2】。然而，ROSI技术尚没有在临床上得到广泛的应用，这在很大程度上是由于ROSI胚胎仍普遍存在发育效率低下的问题【3】。先前的研究曾报道了ROSI胚胎存在表观修饰异常，如组蛋白修饰、DNA甲基化或染色质浓缩【4, 5】，但ROSI胚胎发育效率低下的机制及能否利用小分子化合物提高其发育效率，目前尚不明确。
2022年08月11日，南方医科大学赵小阳课题组、深圳大学常港课题组和南方医科大学李琳课题组在Science Advances杂志发表题为Single-cell multi-omics sequencing reveals the reprogramming defects inembryos generated by round spermatid injection的研究论文。该研究首次系统阐明了小鼠圆形精子注射（ROSI）胚胎的发育障碍，尤其是原核阶段的表观遗传重编程缺陷，并进一步利用组蛋白甲基转移酶G9A的小分子抑制剂A366显著提高圆形精子注射（ROSI）胚胎的囊胚发育率和活产率。
研究人员首先利用单细胞多组学测序技术，同时检测了ROSI和ICSI着床前胚胎的转录组、染色质开放状态和DNA甲基化。通过比较发现，原核时期是ROSI胚胎发育重编程的关键阶段：原核期ROSI胚胎的初级合子激活（minor ZGA）基因表达出现异常下调，同时DNA甲基化与染色质开放的异常也主要集中在原核时期，部分下调的minor ZGA基因与异常的DNA高甲基化和染色质关闭密切相关，这些基因均参与了染色质和细胞骨架组装等生物学事件。此外，研究人员发现ROSI胚胎的雄原核中的H3K9me2修饰显著高于对照组ICSI胚胎，且直径偏小。以上实验证明了ROSI胚胎在原核期存在明显的表观遗传修饰重编程异常。
针对ROSI胚胎原核时期存在的表观遗传修饰缺陷，研究人员筛选了178个与此相关的小分子化合物，最终发现G9A (EHMT2) 的小分子抑制剂A366能够将小鼠ROSI胚胎的囊胚发育率和活产率提高约两倍。EHMT2作为组蛋白的甲基化转移酶，直接参与调控H3K9me2修饰的建立，同时与DNA甲基化修饰密切相关【6】。研究人员进一步发现ROSI胚胎PN3时期中的Ehmt2表达量明显高于对照组ICSI胚胎。通过卵胞质内注射靶向Ehmt2的siRNA能够显著提高小鼠ROSI胚胎的囊胚发育率；相反，若在小鼠ROSI胚胎过表达Ehmt2，则会进一步降低其囊胚发育率。而在ROSI胚胎中过表达Ehmt2的同时添加A366，则无法提高胚胎的发育效率。以上实验证实了EHMT2介导的H3K9me2修饰异常是ROSI胚胎发育效率低下的重要原因。最后，研究人员发现A366处理的ROSI活产小鼠的成长期体重和产仔数与对照组ICSI胚胎无统计学差异，这在一定程度上证明了A366处理的生物安全性（图1）。
图1：小分子化合物A366能够显著提高小鼠ROSI胚胎的发育效率
为进一步阐明A366提高ROSI胚胎发育效率的作用机制，研究人员利用单细胞多组学测序技术，发现A366处理能部分修复小鼠ROSI胚胎中minor ZGA基因的异常表达，并部分修复了差异的DNA甲基化和染色质开放区域，相关的基因和位点均与微管骨架的组装相关，且ROSI胚胎雄原核的形态在A366处理后能够得到一定的恢复。以上实验证明了A366能够通过改变表观遗传和转录组状态来部分修复原核阶段的重编程缺陷，从而提高ROSI胚胎的发育效率。
综上所述，研究人员首次系统解析了小鼠ROSI胚胎原核时期的重编程缺陷。该研究进一步发现G9A介导的H3K9me2修饰异常是ROSI胚胎发育效率低下的重要原因，利用小分子化合物A366干预这一过程能够显著提高ROSI胚胎的囊胚发育率和活产率。这项研究找到了提高ROSI胚胎发育效率的新途径，为ROSI技术的优化提供了新的思路。
南方医科大学王京博士，周偲博士，中国农业大学高帅研究员，宋秀玲硕士，博士生杨昕衍为本文的并列第一作者。南方医科大学赵小阳教授，深圳大学常港研究员和南方医科大学李琳教授为本文的共同通讯作者。
原文链接：
http://doi.org/10.1126/sciadv.abm3976
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赵小阳教授现为南方医科大学基础医学院副院长，教育部长江学者特聘教授、国家优青、教育部青年长江学者、国家万人计划青年拔尖人才入选者。主要从事生殖细胞发育与再生研究，在Nature，Cell Stem Cell，Cell Research, Nature Communications, Science Advances等刊物上发表SCI论文近60篇，申报专利11项。课题组主要利用多种组学技术研究人类精子发生过程和不育症的发病机制；利用干细胞技术和组织工程技术构建人工睾丸组织，实现精子细胞再生；利用该模型进行小分子化合物筛选可促进精子发生的药物。现招聘博士后，期待并欢迎您的加入！
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参考文献
1. A. Ogura, R. Yanagimachi, Round spermatid nuclei injected into hamster oocytes from pronuclei and participate in syngamy. Biology of reproduction 48, 219 (Feb, 1993).
2. A. Ogura, J. Matsuda, R. Yanagimachi, Birth of normal young after electrofusion of mouse oocytes with round spermatids. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 91, 7460 (Aug 2, 1994).
3. A. Tanaka et al., Fourteen babies born after round spermatid injection into human oocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 112, 14629 (Nov 24, 2015).
4. S. Kishigami et al., Epigenetic abnormalities of the mouse paternal zygotic genome associated with microinsemination of round spermatids. Dev Biol 289, 195 (Jan 1, 2006).
5. Y. K. Kurotaki et al., Impaired active DNA demethylation in zygotes generated by round spermatid injection. Hum Reprod 30, 1178 (May, 2015).
6. G. Auclair et al., EHMT2 directs DNA methylation for efficient gene silencing in mouse embryos. Genome research 26, 192 (Feb, 2016).
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