狼疮肾炎（LN）是系统性红斑狼疮（SLE）严重且常见的并发症之一[1]。研究表明，LN的发病机制与补体的激活相关[2,3]。多项临床数据研究显示，7%~31%的SLE患者在SLE初次诊断时即被诊断为LN，31%~48%的SLE患者在随访期间被诊断为LN，4%~28%的LN患者最终进展为终末期肾病（ESRD）[4]。临床上SLE与LN的治疗主要以免疫抑制剂与激素为主，但无论是单纯激素治疗还是免疫抑制剂治疗抑或联合治疗方案，均仅对部分患者有效，且激素治疗和免疫抑制剂治疗常伴有严重的并发症，如感染、心血管疾病、骨质疏松症等[5,6,7]。中药复方肾怡（SY）是中国人民解放军总医院肾脏病科的自拟方剂，原方为莲慈汤[8]，由白术、败酱草、半边莲、补骨脂、黄连、女贞子、三棱、王不留行等药物组成，药物主要归肾、肝、脾经，处方功效为活血化瘀、补肾滋阴、清热解毒、利水消肿。前期研究显示复方SY可以通过影响MRL/lpr小鼠体内CD4 T淋巴细胞分化，纠正肾脏组织中的辅助性T（Th）1/Th2细胞的比例失衡，从而改善动物的肾脏损害[9,10]。中医药对疾病的治疗常以多靶点、多通路发挥作用，本研究将探讨复方SY对LN小鼠的治疗作用及对小鼠补体旁路途径激活的影响。
1 材料与方法1.1 实验动物本次动物实验按照中国人民解放军总医院医学伦理委员会审批的试验方案（伦审第S2019-095-01号）进行。研究时间为2021年4—7月。SPF级MRL/lpr小鼠（8周龄）购于卡文斯百格（苏州）（CAVENS BIOGLE）模式动物研究有限公司，共35只，初始体质量为（26.6±1.3）g；SPF级C57BL/6J小鼠（8周龄）购于斯贝福（北京）生物技术有限公司，共6只，初始体质量为（18.4±0.6）g。将上述MRL/lpr小鼠依据随机数字表法分为MRL/lpr组（n=8）及SY低剂量组（n=9）、SY中剂量组（n=9）、SY高剂量组（n=9），C57BL/6J小鼠为正常对照组（n=6）。上述动物均饲养于解放军总医院医学实验动物中心，SPF环境下光暗循环12 h，温度保持24~26 ℃。实验前动物均适应性喂养4周。
1.2 药品及药液制备SY方：半边莲20 g，败酱草20 g，女贞子18 g，补骨脂15 g，王不留行15 g，三棱10 g，黄连10 g，白术10 g。中药饮片购置于北京仟草中药饮片有限公司，饮片生产执行标准为《中华人民共和国药典（2015年版）》，生产许可证号：京20150129。将中药饮片混匀，用纯水洗净后再加入纯水煎煮2次，冷冻、干燥、浓缩制成含药浓度为1 g/ml汤剂（低剂量）、3 g/ml汤剂（中剂量）、6 g/ml汤剂（高剂量）。0.9%氯化钠溶液为山东齐都药业有限公司生产（国药准字：H37020765）。
1.3 主要试剂与仪器检测试剂盒：尿蛋白检测试剂盒（南京建成，C035-2-1），尿肌酐检测试剂盒（Bioassay，DICT-500），抗双链DNA抗体（anti-dsDNA）检测试剂盒（Alpha Diagnostic International，5120），抗核抗体（ANA）检测试剂盒（Alpha Diagnostic International，5210），免染制胶试剂盒（美国Bio-Rad公司，1610185），BCA蛋白检测试剂盒（Thermo，23225）。荧光抗体：C3（英国Abcam公司，ab4212），免疫球蛋白（Ig）G（Jackson，115-025-003），C5b-9（Bioss，bs-2673R-FITC）。WB一抗：α平滑肌肌动蛋白（α-SMA）（Proteintech，55135）；Ⅰ型胶原蛋白（CollagenⅠ）（Proteintech，14695）；Fibronectin（Proteintech，15613）；C3（Proteintech，21773-1-AP）；C5（GeneTex，GTX33052）；CD35（Genetex，GTX37450）；甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）（Proteintech，10494-1-AP）；WB二抗（碧云天，A0208）。仪器：真空冷冻干燥饥（上海科兴仪器有限公司，ZLGJ-10），酶标仪（TECAN，SPARK 30086376），光学显微镜（奥林巴斯，BX53F），共聚焦显微镜（奥林巴斯，FV1000-D）；组织研磨仪（QIAGEN，tissuelyserⅡ），超声波破碎仪（SonicsVibra-Cell），蛋白转印系统（美国Bio-Rad公司，Trans-Blot Turbo），蛋白电泳仪（美国Bio-Rad公司，PowerPac Basic），成像分析系统（Bio-Rad，Chemidoc MP）。
1.4 动物干预治疗以各组对应剂量灌胃，根据动物实验与成人体表面积换算法，确定复方SY干预剂量如下：SY低剂量组为15.34 g/kg，SY中剂量组为46.02 g/kg、SY高剂量组为92.04 g/kg，MRL/lpr组及正常对照组给予每日0.5 ml 0.9%氯化钠溶液灌胃。于小鼠第12周龄时开始干预，持续干预14周，1次/d。
1.5 检测指标及方法1.5.1 动物体征观察小鼠取材前毛色、皮损情况、精神状态、脾脏大小、体质量等情况，体质量用电子秤称量。采用体征分数量化动物体征，体征量化评分细则：（1）头面部皮损累及胡须计1分，累及皮毛计1分，累及躯干计1分；（2）SY各剂量组及MRL/lpr组脾脏与同周龄正常对照组脾脏长度均数相比，长度每增加0.1 cm计0.1分；（3）实验终点（小鼠26周龄）体质量与起始（小鼠12周龄）体质量差值，终点体质量每下降0.1 g计0.1分，增加0.1 g计-0.1分。体征量化分值越小，表明狼疮损伤越小。
1.5.2 尿蛋白检测于给药第9、10、11、12、13周收取随机尿，采用考马斯亮蓝（CBB法）检测尿蛋白，根据试剂盒说明操作，使用酶标仪在光密度（OD）595 nm、光径1 cm处测定OD值，计算尿蛋白浓度。
1.5.3 尿肌酐检测于给药第9、10、11、12、13周收取随机尿，采用苦味酸法检测尿肌酐，根据试剂盒说明操作，使用酶标仪在OD 520 nm处测定OD值，计算尿肌酐浓度。结合尿蛋白、尿肌酐结果，计算小鼠尿蛋白与尿肌酐比值（UPCR）。
1.5.4 血清anti-dsDNA、ANA浓度检测采用ELISA法检测anti-dsDNA、ANA浓度。干预14周后处死动物，腹主动脉取全血，室温静置30 min后，3 000 r/min、20 min离心，收集上层透明血清样本。根据试剂盒说明操作，使用酶标仪在OD 405 nm处测定OD值。
1.5.5 肾脏组织病理检查干预14周后处死小鼠进行取材，取肾脏组织于4%多聚甲醛溶液（4%PFA溶液）中固定48 h后，梯度乙醇脱水，透明，浸蜡，包埋，石蜡切片（2 μm），苏木素-伊红染色（HE染色）及高碘酸—希夫染色（PAS染色），封固后采用普通光学显微镜观察，并通过图像采集系统采集图像。
1.5.6 C3、免疫球蛋白G（IgG）、C5b-9免疫荧光染色取肾脏组织于4%PFA溶液中固定48 h后，梯度蔗糖脱水，OCT包埋，冰冻切片（4 μm），透化、封闭、抗体（直标）孵育、洗涤、4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）封片，采用共聚焦显微镜观察，通过图像采集系统采集图像，Image J软件对各组荧光强度（IOD）进行半定量分析。
1.5.7 肾脏组织靶标蛋白检测采用Western blotting法对肾脏组织靶标蛋白进行半定量分析。组织样本中加入RIPA裂解液，研磨粉碎，超声波破碎仪裂解肾脏细胞，12 000 r/min、4 ℃离心30 min，取上清液，采用BCA法测样本蛋白浓度并配平，上样、电泳、转膜、封闭、一抗（1∶1 000）孵育、二抗（1∶1 000）孵育（括号内为稀释比例），一抗靶标蛋白为α-SMA、CollagenⅠ、Fibronectin、C3、C5、CD35、GAPDH，显影成像。使用Image J软件对各组靶标蛋白及内参蛋白条带灰度值进行半定量分析。
1.6 统计学方法采用GraphPad Prism 8.0.1软件进行统计学分析。计量资料首先进行Shapiro-wilk正态性检验，符合正态分布的资料以（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，其中正常对照组和SY各剂量组分别与MRL/lpr组比较采用Dunnett-t检验。不符合正态分布计量资料以M（P25，P75）表示，多组间比较采用非参数检验，其中正常对照组和SY各剂量组分别与MRL/lpr组比较采用配对秩和检验。以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果2.1 各组小鼠一般情况对比截至给药结束，正常对照组6只小鼠存活，MRL/lpr组3只小鼠存活，SY低、中、高剂量组分别有5、7、9只小鼠存活。
自干预第8周起，MRL/lpr组和SY各剂量组小鼠开始出现不同程度的皮损；与MRL/lpr组相比，SY各剂量组小鼠头面部及躯干部皮损较轻（图1）。SY各剂量组小鼠脾脏长度明显小于MRL/lpr组（图1）。
5组小鼠体征量化分值比较，差异有统计学意义（P<0.05）。正常对照组、SY中剂量组、SY高剂量组小鼠体征量化分值均低于MRL/lpr组，差异有统计学意义（P<0.05），见表1。
5组小鼠干预第9、10、11、12、13周UPCR比较，差异有统计学意义（P<0.05）；正常对照组、SY各剂量组小鼠干预第9、10、11、12、13周UPCR均低于MRL/lpr组，差异有统计学意义（P<0.05），见表2。
5组小鼠干预14周后血清anti-dsDNA、ANA水平比较，差异有统计学意义（P<0.05）；正常对照组、SY低剂量组、SY高剂量组小鼠干预14周后血清anti-dsDNA水平低于MRL/lpr组，差异有统计学意义（P<0.05）；正常对照组、SY各剂量组小鼠干预14周后血清ANA水平低于MRL/lpr组，差异有统计学意义（P<0.05），见表3。
干预14周后，HE染色可见MRL/lpr组小鼠肾小球内有免疫复合物沉积，PAS染色可见肾小球内有新月体形成；HE染色可见SY各剂量组小鼠肾小球大致正常，而PAS染色可见SY中、高剂量组小鼠肾小球内有系膜细胞增生，伴少量炎细胞浸润（图2）。
5组小鼠干预14周后肾脏组织C3、IgG、C5b-9免疫沉积比较，差异有统计学意义（P<0.05）；正常对照组、SY各剂量组小鼠干预14周后肾脏组织C3、C5b-9沉积低于MRL/lpr组，差异有统计学意义（P<0.05）；SY低剂量组、SY高剂量组小鼠干预14周后肾脏组织IgG免疫沉积低于MRL/lpr组，差异有统计学意义（P<0.05），见表4、图3，图4，图5。
5组小鼠干预14周后肾脏组织α-SMA蛋白水平比较，差异无统计学意义（P>0.05）；5组小鼠干预14周后肾脏组织CollagenⅠ、Fibronectin、C3、C5、CD35蛋白水平比较，差异有统计学意义（P<0.05）；SY高剂量组小鼠干预14周后肾脏组织CollagenⅠ、Fibronectin、C3、C5、CD35蛋白水平低于MRL/lpr组，差异有统计学意义（P<0.05）；SY低、中剂量组小鼠干预14周后肾脏组织Fibronectin、C3、C5、CD35蛋白水平低于MRL/lpr组，差异有统计学意义（P<0.05）；正常对照组小鼠干预14周后肾脏组织Fibronectin蛋白水平低于MRL/lpr组，差异有统计学意义（P<0.05），见表5、图6。SY对小鼠肾脏组织补体蛋白调节的影响通路图见图7。
多项研究表明，补体旁路途径的激活导致补体蛋白的表达异常，与SLE及LN的发病相关[11,12,13]。LN与补体激活相关的发病机制主要为：循环免疫复合物沉积于肾小球毛细血管内，激活机体补体系统，介导过敏性毒素的释放，进而趋化免疫细胞聚集，释放过氧化物及组织蛋白酶，补体系统激活后形成C5b-9，介导肾脏组织免疫损伤[14]。目前，临床LN的治疗主要以糖皮质激素及免疫抑制剂为主，但无论是哪种方案，均伴随严重的药物不良反应。LN可归属为中医学的"阴阳毒""红蝴蝶疮"及"虚劳"等范畴[15]。LN的中医病机以虚、热、瘀、毒为主，辨证论治以补肾虚，去邪热，除瘀毒，特别以活血化瘀贯穿治疗始末[16]。复方SY以三棱、王不留行为君，女贞子、白术为臣，半边莲、黄连、败酱草、补骨脂为佐药，功效为活血化瘀，补肾滋阴，清热解毒，利水消肿。现代药理研究表明，复方SY具有调节机体免疫、抑制肾脏系膜细胞增殖、肾小球硬化、炎细胞浸润等作用[8,9,10]。
本研究结果显示，小鼠20周龄时，MRL/lpr组较SY各剂量组出现较为严重的皮损及体质量减轻等类狼疮症状，26周龄（实验终点时）症状加重，提示复方SY可抑制MRL/lpr小鼠的免疫亢进，缓解类SLE症状体征。肾脏病理结果同时提示复方SY可改善MRL/lpr小鼠狼疮肾脏损害。本研究结果显示，正常对照组、SY各剂量组小鼠干预第9、10、11、12、13周UPCR均低于MRL/lpr组，表明复方SY对MRL/lpr小鼠狼疮肾损伤有保护作用，可能改善LN的预后。
血清anti-dsDNA、ANA水平是临床诊断SLE、LN的参考指标之一[17,18,19]。血清中anti-dsDNA、ANA水平与肾脏受累程度相关[20,21]。本研究结果显示，正常对照组、SY低剂量组、SY高剂量组小鼠干预14周后血清anti-dsDNA水平低于MRL/lpr组，正常对照组、SY各剂量组小鼠干预14周后血清ANA水平低于MRL/lpr组；提示复方SY干预治疗可降低小鼠血清ANA水平，而经过复方SY低剂量及高剂量治疗可降低小鼠血清anti-dsDNA水平，进一步说明复方SY可能降低MRL/lpr小鼠血清自身抗体含量，缓解肾脏免疫受累。
免疫球蛋白与补体蛋白在肾脏的沉积可作为LN免疫损伤严重程度的评判标准。各组小鼠肾脏组织C3、IgG、C5b-9免疫荧光染色及IOD半定量分析结果显示，正常对照组、SY各剂量组小鼠干预14周后肾脏组织C3、C5b-9沉积低于MRL/lpr组，SY低剂量组、SY高剂量组小鼠干预14周后肾脏组织IgG免疫沉积低于MRL/lpr组；提示复方SY干预可减少肾脏组织补体和免疫球蛋白沉积，缓解肾脏组织免疫炎性损伤。本研究结果还显示，SY高剂量组小鼠干预14周后肾脏组织CollagenⅠ、Fibronectin蛋白水平低于MRL/lpr组，正常对照组小鼠干预14周后肾脏组织Fibronectin蛋白水平低于MRL/lpr组，差异有统计学意义，提示高剂量复方SY的干预可能延缓LN肾脏纤维化进展。
补体系统作为生物体内的非特异性免疫系统，与SLE、LN发病相关[2,3]。ELLIOTT等[22]、WATANABE等[23]关于SLE与补体因子的研究推翻了长期以来人们认为的补体系统主要是通过经典途径的激活而影响SLE的发病，旁路途径的激活可能是SLE乃至LN发病的关键环节。补体旁路途径激活后，C3分解为C3a、C3b，C5分解为C5a、C5b，C5b与C6、C7、C8、C9结合成C5b-9，介导细胞非特异性免疫攻击。补体分子依赖于与补体受体的结合而发挥作用，CD35是补体分子C3b、C4b的特异性受体，其表达量可间接反映补体途径的激活情况。本研究结果显示，SY高剂量组小鼠干预14周后肾脏组织C3、C5、CD35蛋白水平低于MRL/lpr组，表明复方SY干预后C3、C5蛋白水平降低，提示复方SY可能抑制补体蛋白在肾脏沉积，甚至抑制补体蛋白的合成；CD35蛋白是C3b与C4b的受体，SY干预后，CD35表达水平降低，提示复方SY可能抑制补体途径的激活；免疫荧光结果提示SY干预后的肾小球内C5b-9表达水平降低，复方SY可能抑制补体旁路途径激活，减轻补体介导的肾脏免疫损伤。综上，复方SY三个剂量干预MRL/lpr小鼠均不同程度改善LN的肾脏免疫损伤，其中以SY高剂量干预改善较明显。
本研究尚存在一定的不足：（1）中药复方汤剂有效成分复杂，本研究未对复方SY中药汤剂的单个有效成分进行药理分析。（2）中药干预、治疗疾病通常以多靶点、多通路机制发挥作用，本研究只在补体通路途径进行机制验证，对复方SY治疗LN的机制研究尚不充分。（3）由于本研究药物干预时间较长，样本量较少，各组动物干预过程存在死亡等不确定性因素，导致存在数据缺失情况。在接下来针对中药复方SY的深入研究中，上述的几点研究不足将会被着重考虑。
综上所述，本研究的优势在于系统性地阐述了复方SY对MRL/lpr小鼠LN的治疗作用，并且从补体旁路途径的激活方面验证复方SY缓解LN肾脏免疫损伤的治疗机制，为未来临床开发运用复方SY治疗LN提供了理论依据。
本文无利益冲突。
参考文献 略
本文来源：陈铿, 邓翼遥, 尚顺来, 等. 复方肾怡治疗狼疮肾炎小鼠的疗效及对补体旁路途径激活的研究[J]. 中国全科医学, 2022, 25(26): 3298-3307.（点击文题查看原文）
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