1、菌种活化:干粉标准菌株 标准贮备菌株 工作菌株;

1.1 金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌标准菌株:挑取部分干粉溶解于0.9%无菌氯化钠溶液中,划线接种于营养琼脂平板上,36℃±1℃培养18-24小时。并观察菌落形态。

a.金黄色葡萄球菌:菌落凸起,圆形,不透明;

b.大肠埃希氏菌:菌落稍凸,圆形,湿润,乳白色;

c.铜绿假单胞菌:菌落扁平,圆形,边缘不整齐,光滑湿润,可产生蓝绿或黄绿色素;

d. 枯草芽孢杆菌:表面粗糙不透明,镜检菌体有芽孢。

1.2 白色念珠菌:挑取部分干粉溶解于0.9%无菌氯化钠溶液中,划线接种于改良马丁琼脂培养基平板或PDA琼脂平板上,30℃-35℃培养24-48小时。本菌细胞呈卵圆形,很象酵母菌,比葡萄球菌大5~6倍,革兰氏染色阳性,但着色不均匀。

黑曲霉:挑取部分干粉溶解于0.9%无菌氯化钠溶液中,划线接种于改良马丁琼脂斜面培养基上,23℃-28℃培养48-96小时。菌丛呈黑褐色,粗糙。

1.3 生孢梭菌:挑取部分干粉溶解于0.9%无菌氯化钠溶液中,接种于硫乙醇酸盐流体培养基中,30℃~35℃培养18-24小时;或在厌氧条件下接种于哥伦比亚琼脂上,30℃~35℃厌氧培养18-24小时。

2、菌种鉴定:

2.1 金黄色葡萄球菌:

革兰氏染色试验:革兰氏阳性菌(紫色),葡萄状排列,球菌。

兔血浆试验:接种1个单菌落于1支兔血浆溶液中,30℃-35℃培养至6小时,每半小时观察一次。凝固为阳性。金黄色葡萄球菌为阳性反应。

2.2 大肠埃希氏菌:

革兰氏染色试验:革兰氏阴性杆菌,红色。

IMViC生化试验:

标准菌株使用标准(标准菌株验证鉴定步骤)(1)

2.3 铜绿假单胞菌:

革兰氏染色试验:革兰氏阴性杆菌,红色。

氧化酶试验:将氧化酶试纸用蒸馏水浸湿,用细玻璃棒或一次性接种针挑取单个菌落,涂在试纸上。在60s内变为蓝色或蓝紫色为阳性,不变色为阴性。

绿脓菌素试验:取斜面培养物接种于PDP琼脂培养基斜面上,培养24小时,加三氯甲烷3~5ml至培养管中,搅碎培养基并充分振摇。静置片刻,将三氯甲烷相移至另一试管中,加入1mol/L盐酸试液约1ml,振摇后,静置片刻,观察。若盐酸溶液呈粉红色,为绿脓菌素试验阳性,否则为阴性。本菌为绿脓菌素试验阳性。

荧光试验:接种于金氏B培养基(或假单胞菌产荧光色素培养基)上,36℃±1℃培养18-24小时,在366nm紫色灯下有蓝绿色荧光。

2.4 枯草芽孢杆菌:

菌落形态:表面粗糙不透明,有皱摺。

镜检:用芽孢染色液染色,菌体有芽孢。

2.5 白色念珠菌:

革兰氏染色试验:呈卵圆形,很象酵母菌,比葡萄球菌大5~6倍,革兰氏染色阳性,但着色不均匀。

念球菌显色培养基:30-35℃培养24-48小时,呈绿色菌落。

产芽管试验:挑取1%吐温80-玉米琼脂培养基上的培养物,接种于加有一滴血清的载玻片上,盖上盖玻片,置湿润的平皿内,置35~37℃、1~3小时,置显微镜下观察,可见到由孢子长出短小芽管。

2.6 黑曲霉:23℃-28℃培养48-96小时。菌丛呈黑褐色,粗糙,有黑色孢子产生。

2.7 生孢梭菌:

革兰氏染色试验:革兰阳性梭菌,有或无卵圆形或球形的芽孢。

哥伦比亚琼脂培养基试验:接种于含庆大霉素的哥伦比亚琼脂培养基平板上,置厌氧条件下培养48~72小时,应生长。

过氧化氢酶试验:滴加3%过氧化氢试液,若菌落表面有气泡产生,为过氧化氢酶试验阳性,否则为阴性。本菌为阴性反应。

3、所需试剂:

标准菌株使用标准(标准菌株验证鉴定步骤)(2)

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