李斯特氏菌在环境中无处不在，绝大多数食品中都存在该菌。肉类、蛋类、海产品、乳制品、蔬菜等都已被证实是李斯特氏菌的感染源。目前国际上公认的李斯特氏菌共有7个菌株：单核细胞增生李斯特氏菌、绵羊李斯特氏菌、英诺克李斯特氏菌、威尔斯李斯特氏菌、西尔李斯特氏菌、格氏李斯特氏菌、默氏李斯特氏菌7个种。其中单核细胞增生李斯特氏菌对人类致病性强，绵羊李斯特氏菌对人类也有一定致病性，其余的李斯特氏菌无致病性。
单核细胞增生李斯特氏菌是一种人畜共患病的病原菌。它能引起人、畜的李氏特氏菌病，感染后主要表现为败血症、脑膜炎和单核细胞增多。它广泛存在于自然界中，食品中存在的单核细胞增生李斯特氏菌对人类的安全具有危险，该菌在4℃的环境中仍可生长繁殖，是冷藏食品威胁人类健康的主要病原菌之一，检测该菌具有重要的公共卫生意义。
1 病原学特征
李斯特氏菌为两端钝圆、稍弯曲的小杆菌，大小为（0.4～0.5）μm×（0.5～2）μm，有时呈弧形（图2-7）。多单在，有时排成V形或栅状。R型菌落中的细菌呈长丝状，长达50～100μm。在20～25℃下可形成4根周身鞭毛，能运动；但在37℃下可形成更少甚至1根鞭毛。该菌无荚膜，无芽孢。革兰氏染色阳性，培养时间长的菌体有时可脱色为阴性。常呈两极染色，无抗酸性。在感染动物的组织内呈球杆菌状。
该菌为需氧及兼性厌氧菌，在普通琼脂上可生长，但在含血或血清琼脂上生长更好。在血琼脂上生长时，菌落周围有狭窄溶血环（图2-8）；在血清琼脂上可形成圆形、光滑、透明、淡蓝色小菌落，直径为1～2mm。肉汤培养呈均匀浑浊，有颗粒状沉淀，不形成菌环及菌膜。该菌不产生硫化氢及靛基质，不还原硝酸盐，石蕊牛乳在24h内变酸，但不凝固。MR试验及VP试验均为阳性。该菌在麦康凯培养基上不生长，菌体不分枝，过氧化氢酶阳性。
李斯特氏菌为腐生菌，生存能力强，能耐受培养基中含有0.04%的亚碲酸钾、0.025%的铊酸、3.75%硫氰酸钾、10%氯化钠和40%胆汁；能在2～42℃下生存（在0℃下能缓慢生长），能在冰箱冷藏室内较长时间生长繁殖；在酸性、碱性条件下都适应。短时间的高温巴氏消毒可以杀死李斯特氏菌。
2 流行病学特征
单核细胞增生李斯特氏菌广泛存在于自然界中，土壤、地表水、污水、废水、植物、青贮饲料、烂菜中均有该菌存在，多种动植物食品、人畜排泄物、污水和青贮饲料中均可检出。人和多种动物均可成为其宿主。动物很容易食入该菌，并通过口腔-粪便的途径进行传播。人主要通过食入软奶酪、未充分加热的鸡肉、未再次加热的热狗、鲜牛奶、巴氏消毒奶、冰激凌、生牛排、羊排、卷心菜色拉、芹菜、西红柿、法式馅饼、冻猪舌等而感染，有85%～90%的病例是由食入被污染的食品而感染的。
该菌可通过眼及破损皮肤、黏膜进入体内而造成感染，孕妇感染后通过胎盘或产道感染胎儿或新生儿，栖居于阴道、子宫颈的该菌也引起感染，性接触也是李斯特氏菌病传播的可能途径，且有上升趋势。
3 危害
单核细胞增生李斯特氏菌是近年来已被重视的病原菌。食品作为传播单核细胞增生李斯特氏菌的媒介亦渐被重视。WHO关于单细胞增生李斯特氏菌食品中毒报告指出，4%～8%的水产品、5%～10%的乳及乳制品、30%以上的肉制品及15%以上的家禽均被该菌污染。由于该菌在4℃冰箱保存的食品中也能生长繁殖，其危害性进一步增大。
1981年加拿大沿海发生的单核细胞增生李斯特氏菌暴发性流行经证实是由于单核细胞增生李斯特氏菌污染的卷心菜色拉所致。1983年6月美国的马萨诸塞州发生单核细胞增生李斯特氏菌中毒，经流行病学调查发现是由于饮用了含有单核细胞增生李斯特氏菌的巴氏消毒奶，调查结果表明为存在于患病奶牛所产奶细胞内部的单核细胞增生李斯特氏菌有很强的耐热力所致。1999年底，美国发生了历史上因食用带有单核细胞增生李斯特菌的食品而引发的最严重的食物中毒事件，据美国疾病控制与预防中心资料显示，在美国密歇根州有14人因食用被该菌污染的热狗和熟肉而死亡，在另外22个州97人患该病，6名妇女流产。
1992—1995年在法国出产的奶酪及猪肉中发现单核细胞增生李斯特氏菌，自2001年11月以来，我国质检部门多次从美国、加拿大、法国、爱尔兰、比利时、丹麦等20多家肉类加工厂进口的猪腰、猪肚、猪耳、小排等30多批近千吨猪副产品中检出单核细胞增生李斯特氏菌。
4 检测方法
包括病原的分离鉴定及分子生物学方法、免疫学方法等。
4.1 细菌分离鉴定
（1）样品处理 将样品保存于4℃冰箱中，若条件适宜，单核细胞增生李斯特氏菌会缓慢生长，若样品已被冷冻，则应在检测前解冻。
（2）预增菌与增菌 取25g样品放入225mL的李氏增菌肉汤（BLEB）中，混匀，进行预增菌培养。30℃培养4h后，加入放线菌酮或匹马菌素等选择性试剂，继续30℃增菌培养48h。巴氏消毒奶、奶制品、酸奶酪、冷冻水产品等含有较少的酵母菌和较少霉菌，因此不需加入抗真菌剂。但生乳、干的海产品或新鲜产品则需加入抗真菌剂。
（3）分离纯化 取增菌培养液划线接种于含七叶苷的选择分离培养基上：PALCAM琼脂平板、（改良）牛津琼脂平板或加入七叶苷和三价铁的LPM琼脂平板。以上含七叶苷的培养基根据具体要求而选用。（改良）牛津琼脂平板、PALCAM琼脂平板接菌后放置于35℃培养24～48h，含七叶苷和三价铁的LPM琼脂平板接菌后放置于30℃培养24～48h。在含七叶苷的培养基上，李斯特氏菌呈黑色，菌落周围具有黑色的环。从这些培养基上挑取5个可疑菌落划线接种到胰蛋白胨大豆胨培养基上，分离纯化单菌落。同样也可划线接种到BCM李斯特氏菌显色培养基上，单核细胞增生李斯特氏菌呈蓝色，而绵羊李斯特氏菌在食品中不常见。单核细胞增生李斯特氏菌和绵羊李斯特氏菌在ALOA李斯特氏菌显色培养基上都呈蓝色且在菌落周围有酯酶环。在传统的检测方法中，利用胰蛋白胨大豆胨培养基进行菌落纯化是必须的，因为选择性培养基上分离出的菌落仍有可能包涵其他细菌。至少挑取5个菌落进行鉴定，因为在同一样品中可能含有几种李斯特氏菌，而利用BCM和ALOA李斯特氏菌显色培养基可以减少挑取的菌落数。运用商业的Confirmatory培养基，或传统的木糖/鼠李糖发酵肉汤或琼脂，可以区别单核细胞增生李斯特氏菌和绵羊李斯特氏菌。胰蛋白胨大豆胨琼脂平板需在30℃培养24～48h，若不需观察运动，也可在35℃培养。对于这些认可的方法，可以用选择性琼脂分离李斯特氏菌，也可以辅助使用推荐的新的单核细胞增生李斯特氏菌Ｇ绵羊李斯特氏菌分离培养基。
（4）镜检 从30℃或低于30℃培养的平板上挑取生长良好的典型菌落，涂于洁净载玻片上，用0.85%生理盐水制成悬浮液，压上盖玻片于相差显微镜的油镜下观察。李斯特氏菌为短杆状，有轻微的旋转和翻滚运动。而大的杆状或快速运动的杆状细菌则不是李斯特氏菌。应用阳性的李斯特氏菌做对照。革兰氏染色试验：将培养16～24h的培养物进行染色，李斯特氏菌呈短杆状阳性菌。但若培养时间过长，染色会发生变化。
（5）生化鉴定
过氧化氢酶试验：李斯特氏菌阳性反应。
溶血试验：将7%羊血琼脂平板底面划分为20～25个小格，从胰蛋白胨大豆胨琼脂平板上挑取菌落刺种到血琼脂平板上，每格刺种一个菌落，于35℃培养24～48h，穿刺时尽量接近底部，但不要触到底面，同时避免琼脂破裂。于明亮处观察洁净的血琼脂平板，单核细胞增生李斯特氏菌和西尔李斯特氏菌在刺种点周围产生狭小的透明溶血环，英诺克李斯特氏菌无溶血环，绵羊李斯特氏菌产生大的透明溶血环。注意：不应据此来区别李斯特氏各种菌，这仅仅是一种溶血现象。用CAMP试验来确证李斯特氏各种菌。注意：当血琼脂平板的厚度比通常的5mm更薄时，非常容易观察到溶血环，另外这可以通过覆盖一层1～2mm血琼脂来实现。
硝酸盐还原试验：只有默氏李斯特氏菌能降解硝酸盐，可以此区分格氏李斯特氏菌和默氏李斯特氏菌。用胰蛋白胨大豆胨肉汤培养物接种到硝酸盐肉汤中，35℃培养5d，加入0.2mL试剂A（磺胺酸冰醋酸溶液，将对氨基苯磺酸0.8g溶解于2.5mol/L乙酸溶液100mL中），再加入0.2mL试剂B（α-萘胺乙醇溶液，将α-萘胺0.5g溶解于2.5mol/L乙酸溶液100mL中），混匀，如出现紫红色，则表明降解了硝酸盐，存在亚硝酸盐。如无颜色变化，则加入少量锌粉，放置1h，如出现红色，表明仍有硝酸盐存在，未被细菌降解。
动力试验：将胰蛋白胨大豆胨肉汤培养物接种到SIM（硫化物、吲哚、动力）培养基或改良塞耶-马丁（MTM）培养基，室温培养7d，逐日观察，李斯特氏菌有动力，呈伞状生长。在MTM培养基上形状尤为突出，可以明显观察到伞形。另外，通过相差显微镜，可观察30℃胰蛋白胨大豆胨培养基上的培养物的翻滚运动。
糖发酵试验：将胰蛋白胨大豆胨琼脂平板上培养物接种于含以下0.5%糖的紫色肉汤中（可加入小倒管）：葡萄糖、七叶苷、麦芽糖、甘露醇、鼠李糖和木糖。35℃培养7d。阳性反应是产酸，不产气。所有李斯特氏菌对葡萄糖、七叶苷、麦芽糖都是阳性反应。除格氏李斯特氏菌和默氏李斯特氏菌外，其余的李斯特氏菌对甘露醇呈阴性反应。若不同选择性培养基上的纯化物着色是确定的，则七叶苷发酵试验可省略。
（6）小鼠毒力试验检测李斯特氏菌致病性的传统试验是Anton相交试验，既小鼠注射试验和鸡胚注射试验。小鼠抵抗力测定试验是将细菌从腹腔注入，该实验有很高的敏感性，可了解单核细胞增生李斯特氏菌对动物的致病性。
将4mgCarageenan（sigma typeⅡ）溶解在蒸馏水中，注射到18～20g体重的小鼠体内，24h后，李斯特氏菌开始表现毒性。小鼠体内的Carageenan（sigma type II）注射量应依据小鼠的体积而定，一般注射量为每1kg体重注射200mg。分离物在胰蛋白胨大豆胨中35℃培养24h后，再转移到两个管中，35℃培养24h，然后再将10mL的肉汤培养物转移到离心管中，1600r/min离心30min，弃上清液，用1mL灭菌生理盐水制成菌悬液，此时菌浓度为1×1010CFU/mL，稀释成1×105CFU/mL，将0.1mL菌悬液注射到16～18g体重的Swiss小鼠体内，约注入104个菌，观察5d内小鼠的死亡情况。非致病菌不会致小鼠死亡。用致病菌、非致病菌、Carageenan（sigma typeⅡ）处理的小鼠及未注射的小鼠做对照试验。每组试验用5只小鼠，Carageenan（sigma typeⅡ）处理的小鼠应该能够忍受0.1mL的PBS。
4.2 分子生物学鉴定
（1）DNA模板的制备取增菌液1mL于1.5mL离心管中，4000～5000r/min离心5min，弃上清液，向菌沉淀中加入50μL灭菌纯水制成菌悬液，混匀后100℃煮沸10min，12000r/min离心5min，取上清2μL作为PCR模板。
（2）引物设计
引物1：上游引物为5′-TATGTGCGATACCGCTTGAA-3′；下游引物为5′-GAAACTAACGGＧGATAAAACC-3′，扩增片段长度为511bp。
引物2：上游引物为5′-TTATGATGACGAAATGGCTTAC-3′；下游引物为5′-ATGGACGATＧGTGAAATGAGC-3′，扩增片段长度为789bp。
（3）PCR扩增 PCR反应体系25μL，具体成分见表2-7。
PCR反应条件：95℃预变性5min；95℃变性45s，53℃退火50s，72℃延伸45s，30个循环；72℃后延伸8min。4℃保存。
（4）电泳 用电泳缓冲液（1×TAE）制备1.8%～2.0%的琼脂糖凝胶，取5μLPCR扩增产物，分别和2μL上样缓冲液混合进行点样，用DNA分子量标记物做参照，3～5V/cm恒压电泳，电泳20～40min，电泳检测结果用凝胶成像分析系统记录并保存。
（5）结果判定在阴性对照未出现条带、阳性对照出现预期大小的扩增条带条件下，如待测样品未同时出现511bp和789bp大小的两条扩增带，则判为阴性；如待测样品同时出现511bp和789bp大小的两条扩增带，则判为阳性。
如果阴性对照和（或）阳性对照未出现预期大小的扩增条带，则本次检测结果无效，应重新试验。
,
