三聚氰胺（melamine）学名三氨三嗪，别名密胺、氰尿酰胺、三聚酰胺。作为一种重要的化工原料，主要用于生产塑料、胶水和阻燃剂。由于每个三聚氰胺分子中都含有6个氮原子，含氮量高，近年来在饲料生产中被非法添加用于提高饲料中非蛋白氮的含量。2007年美国发生了多起宠物中毒死亡的“毒粮”事件；2008年，我国爆发了因食用含有三聚氰胺的婴儿奶粉引发婴儿尿路结石以及鸡蛋中检出三聚氰胺等一系列事件，使得三聚氰胺这种普通的化工原料引起了全社会的广泛关注。本部分综述了三聚氰胺的理化性质、代谢动力学、毒性、国内外限量要求以及残留检测的样品前处理、仪器测定方法等内容，以期为该类化合物的全面了解和残留检测提供参考。
1理化性质
三聚氰胺是三嗪类含氮杂环有机化合物，分子式为C3N6H6，相对分子质量126.15，分子中66.6%为氮原子，密度1.573g/cm3。室温下三聚氰胺外观为一种白色单斜棱晶体，20℃水中溶解度为31g/L，水沸腾时溶解度增加到25g/L。微溶于乙醇，不溶于乙醚、苯和四氯化碳，可溶于甲醇、甲醛、乙酸、热乙二醇、甘油、吡啶等。常压熔点354℃，快速加热至300℃升华。一般情况下较稳定，高温下可能会分解释放出氰化物。
三聚氰胺的pKb为9.0，水溶液呈弱碱性（pH＝8），与盐酸、硫酸、硝酸、乙酸、草酸等都能形成三聚氰胺盐。在中性或微碱性情况下，与甲醛缩合而成各种羟甲基三聚氰胺，但在微酸性（pH 5.5~6.5）情况下，与羟甲基的衍生物进行缩聚反应而生成树脂产物。遇强酸或强碱水溶液水解，胺基被羟基取代，生成三聚氰酸二酰胺、三聚氰酸一酰胺和三聚氰酸。三聚氰胺及其代谢产物化学结构见图7-12。
2代谢动力学
2.1在动物体内的吸收与分布
Mast等在Fischer344雄性大鼠上的研究发现，大鼠在单剂量口服0.38mg的三聚氰胺后，其在血液、血浆和肝脏中的浓度相似，提示三聚氰胺进入体内后可能分布在全身体液中。Wu等以10mg/kg的剂量给成年大鼠注射三聚氰胺后研究其在机体内的分布，发现大鼠血浆、胰腺、膀胱、肾脏、肝脏和脑中均有三聚氰胺的分布，且在肾脏中的浓度最高。随后研究发现，以100mg/kg的剂量每天给大鼠灌服三聚氰胺，灌服14d后，膀胱、肾脏、胰腺、肝脏中均有三聚氰胺分布，其中膀胱中三聚氰胺浓度最高。研究表明三聚氰胺的给予途径或给予方式不同，三聚氰胺在动物体内的分布不同。
2.2在动物体内的代谢与排泄
目前研究表明，三聚氰胺在机体内的代谢属不活跃代谢或惰性代谢，直接以原型或同系物形式从尿液中排出。Mast等研究指出，大鼠在单剂量口服三聚氰胺后，三聚氰胺会被迅速吸收，60min内血浆中的三聚氰胺达到峰值，90%的三聚氰胺在24h内经肾脏排出体外，而三聚氰胺在大鼠血浆中的半衰期为2.7h，少量的三聚氰胺从大鼠呼气（0.2%）和粪便（0.64%）中排出，同时血浆和肝中的浓度差异较小，但肾脏和膀胱中的浓度明显高于血浆，其中膀胱中的浓度最高，表明三聚氰胺在Fischer344雄性大鼠中并没有经过代谢。Baynes等按6.13mg/kg的剂量给5头断奶仔猪静脉注射三聚氰胺，结果表明三聚氰胺在断奶仔猪血浆中半衰期为4.04h，肾清除率为27mL/min，而表观分布容积为0.61L/kg。黄小燕等研究发现，日粮中添加100mg/kg、500mg/kg和1 000mg/kg三聚氰胺饲喂的仔猪血浆中三聚氰胺半衰期分别为6.53h、6.02h和6.51h。Wu等在大鼠上的研究发现，三聚氰胺的口服生物利用度为98.1%，在单次口服摄入100mg/kg的三聚氰胺后，63%的三聚氰胺在96h后重新在尿液中被检测到。这些研究均表明，三聚氰胺进入动物体内可迅速经肾脏排出，在哺乳动物上，尿液是三聚氰胺排泄的最大途径，而在产蛋鸡上，三聚氰胺也可通过蛋排泄，但不同种属和不同动物间三聚氰胺代谢的差异较大。
2.3在动物产品中的残留和清除
Yi等在产蛋鸡上研究了摄入三聚氰胺污染的日粮后蛋中三聚氰胺的沉积范围，日粮中按5mg/kg、25mg/kg、50mg/kg或100mg/kg的剂量加入三聚氰胺，收集1d、3d、5d、7d、9d、11d、13d、15d的蛋样分析，从第1天到第15天，蛋中三聚氰胺含量差异不显著，说明蛋鸡体内积聚三聚氰胺无累积效应，但随着饲料污染程度的加速呈上升趋势。Wendy等研究发现鱼类摄入299~471mg/（kgd）的三聚氰胺3d后，鲶体内的三聚氰胺含量为81~210mg/kg，鳟体内为34~80mg/kg，罗非鱼体内为0.02~177mg/kg，鲑体内为58~94mg/kg。Bai等研究了三聚氰胺在蛋鸡组织和鸡蛋中的沉积和消除规律，连续饲喂蛋鸡8.6mg/（kg·d）、17.4mg/（kg·d）、33.6mg/（kg·d）、62.6mg/（kg·d）和140.9mg/（kg·d）的三聚氰胺34d，饲料中高剂量的三聚氰胺与组织和蛋中高浓度的三聚氰胺检出有相关性。在所有检测样品中，蛋中三聚氰胺浓度最高，十二指肠浓度最低。当停止添加三聚氰胺第10天后，蛋鸡组织中三聚氰胺浓度降至2.5mg/kg；第7天，蛋中检测不到三聚氰胺；第20天，组织中也检测不到三聚氰胺。Shen等在泌乳期奶牛上研究了不同剂量三聚氰胺从饲料到奶中的转移。分别按照0（对照组）mg/d、90mg/d、270mg/d和450mg/d的剂量，连续饲喂13天，进行为期19天的试验。结果发现，奶中三聚氰胺含量在第3天逐渐增加，停止添加后第4天所有试验组均未检测到三聚氰胺；三聚氰胺从饲料到奶中转移率不受其添加剂量的影响，但与产奶量呈线性相关。王蔚研究了日粮中不同水平的三聚氰胺在育肥猪血液和体组织中的残留和消除规律。试验结果表明，育肥猪摄入三聚氰胺对其采食量、日增重及饲料转化率无显著影响；摄入含0.21~1 000mg/kg三聚氰胺饲料42d后，组织中三聚氰胺的浓度分别为0.04~5.61μg/g（肾脏）、0.03~2.80μg/g（背肌）、0.02~2.58μg/g（肝脏）、0（未检出，ND）~2.56μg/g（脑）、0.02~.252μg/g（心肌）和0.02~2.55μg/g（十二指肠）；摄入含1 000mg/kg三聚氰胺饲料42d后，上述所有组织中三聚氰胺的残留量超过国际上规定的2.5mg/kg的限量标准。停止添加三聚氰胺5d后，育肥猪组织中三聚氰胺的残留快速降至限量标准以下的水平，但三聚氰胺在组织中残留越多，越难得到清除。
3毒性
三聚氰胺在胃的强酸性环境中水解，首先生成三聚氰酸二酰胺，并进一步水解生成三聚氰酸，三聚氰酸在肠道内被吸收进入血液，达到一定浓度后会对机体产生影响。经济合作与发展组织的报告中指出，三聚氰胺的LD50：小鼠为4 550mg/kg（口服），大鼠为3 161mg/kg（口服），且仅高剂量三聚氰胺对动物有毒性效应，属轻微毒性。虽然三聚氰胺毒性较低，但三聚氰胺摄入达到特定量后仍会对生物体产生影响，主要表现为膀胱炎、泌尿系统结石形成等。通过三聚氰胺自身对大鼠影响的研究，美国FDA（2008年）认为，三聚氰胺的每日可耐受摄入量（TDI）为0.63mg/kg。
3.1对泌尿系统的影响
目前认为三聚氰胺的生物学效应的主要靶器官是泌尿系统。由于三聚氰胺在动物体内只通过肾脏清除，且清除速度很快，因此三聚氰胺的毒性主要表现为肾毒性。Clark等在绵羊上的研究发现，给绵羊每天饲喂10g三聚氰胺4周后，绵羊采食量下降，出现少尿症状，死亡前血液中尿素氮和肌酐水平升高；对死亡动物的检查发现动物表现出血性膀胱炎的症状，且有晶体沉积在肾小管中。有研究报道，猪和鱼每日摄入400mg/kg的三聚氰胺后，只能存活3d。Xie等在大鼠上的研究发现，三聚氰胺处理组大鼠的肾出现水肿，重量也比对照组有所提高；组织病理学检查发现高剂量三聚氰胺组和三聚氰胺-三聚氰酸组远曲肾小管有大量的管状扩张和少量的出血，肾小球则是正常的，晶体主要沉积在肾乳头的集合管中，肾间质观察到有炎症发生。Brown等对美国2004年及2007年死于三聚氰胺污染食物的16只猫和犬的临床表现和解剖结果也证实，三聚氰胺主要造成泌尿系统损伤。16只动物都出现了尿毒症，同时在远曲肾小管或集尿管中可见有条纹的独特晶体，结晶颜色淡绿，大部分呈类圆形，部分呈球形。Lam等研究了三聚氰胺对人泌尿系统的影响。结果显示大部分结石位于肾盂，超声测定大小为2.5~18mm，结石直径在10mm以下的患儿，其尿液中三聚氰胺浓度每升高10μg/mmol肌酐，结石直径增加1mm，提示三聚氰胺暴露水平越高，结石越严重，表明肾结石的大小跟尿液中的三聚氰胺浓度呈正相关。Guan等也发现，大部分三聚氰胺结石患儿无明显的临床症状，少部分结石患者出现少尿、血尿、蛋白尿等非特异性表现，部分出现多发性结石及尿道扩张，严重者出现弥漫性肾损害，肾功能衰竭和腹水。Kobayashi等研究了小鼠摄入三聚氰胺和三聚氰酸后肾结晶形成的机制和肾衰竭的发生，结果表明，在单独摄入三聚氰胺或低剂量三聚氰胺-三聚氰酸混合物，肾中未发现晶体，但随着剂量的增加和时间的推移，混合物处理组在小鼠远曲肾小管内和集合管内出现了晶体。这些结果说明单独的三聚氰胺不能诱导晶体的形成或引起肾衰竭。
但研究发现两者同时存在时，毒性则增加。Puschner等分别把三聚氰胺、三聚氰酸及两者的混合物分别以不同剂量给予试验动物（猫），结果显示，在单独给予三聚氰胺或三聚氰酸时，没有引起猫的肾功能损害，而服用两者混合物的猫在48h后出现了肾功能衰竭。Dobson等以SD大鼠为试验对象，单独给予三聚氰胺或三聚氰酸对SD大鼠的肾功能没有影响；而联合给予三聚氰胺与三聚氰酸或给予三聚氰胺与三聚氰酸、三聚氰酸二酰胺、三聚氰酸一酰胺的混合物，结果证明两者或四者的混合物导致了SD大鼠肾功能的损害及肾结石的形成。三聚氰胺与同类物结合在一起，在肾小管中形成一种不溶性的晶体，最终导致管腔的阻塞及肾功能衰竭。
3.2对血液生化指标的影响
黄小燕等研究发现，仔猪饲料中添加三聚氰胺后有降低谷丙转氨酶（GPT）和谷草转氨酶（GOT）活性的趋势。而Wang等在妊娠母鼠上的研究发现，饲喂三聚氰胺对其血液中GPT、GOT的活性无显著影响。王蔚利用日粮添加三聚氰胺饲喂育肥猪的试验，测定了猪血液中谷丙转氨酶、谷草转氨酶的活性及血肌酐和胱抑素C的含量。结果表明，日粮中较高剂量三聚氰胺（1 000mg/kg）的添加使育肥猪血液中的28d的谷丙转氨酶和42d的血肌酐显著升高（P＞0.05），对血浆胱抑素C含量无显著影响。
3.3对繁殖及发育的影响
研究表明，动物长时间接触三聚氰胺会导致不孕和胚胎毒性。Zhang等研究发现，三聚氰胺会增加精子的畸形率和导致DNA的损伤。Wang等在小鼠上研究了三聚氰胺通过胎盘转运的可能性及其对胎儿和妊娠母鼠的影响，发现按低剂量（40mg/kg）和高剂量（400mg/kg）从妊娠期第13天到第20天给F334小鼠强饲三聚氰胺，低剂量组小鼠的羊水中未检测到三聚氰胺，高剂量组血浆和胎儿三聚氰胺含量极显著高于低剂量组，这些结果说明摄入三聚氰胺通过胎盘屏障到达胎儿具有剂量依赖效应，但三聚氰胺剂量的不同并不影响母鼠的体重、胎儿数、胎儿和胎盘的重量，且胎儿的肾脏中也未发现结晶体。
3.4致癌性
按照WHO下属的IARC的划分，三聚氰胺归于第三类致癌物，即其是对人体致癌性尚未归类的物质或混合物。三聚氰胺的致癌性仅在大鼠和小鼠上有研究。雄性大鼠摄入三聚氰胺后会患膀胱、输尿管移行细胞癌；三聚氰胺对雌性大鼠无致癌性，但会引起移行细胞刺瘤的发生，说明三聚氰胺对不同性别的动物毒性不同。雄性大鼠膀胱肿瘤的发生率与泌尿系统结石的形成和持续暴露于高剂量的三聚氰胺高度相关。雄性大鼠患膀胱癌的机制与DNA损伤无关，但可能是由上皮细胞的增生和膀胱中有结晶沉淀导致的。这些研究同时表明，三聚氰胺在造成膀胱结石发生时才会有致癌性。
综上所述，三聚氰胺对生物体（包括人和动物）都具有毒性作用，其主要是对泌尿系统产生损害。三聚氰胺和三聚氰酸单独应用于动物时，本身的毒性作用很低。但它们联合使用时会产生明显的毒性作用，主要对泌尿系统产生损害，包括形成肾结石或膀胱结石，并导致肾功能衰竭或泌尿系统肿瘤形成。它们的毒性具有对动物种的选择性，相对于小鼠，对猫和大鼠的肾脏毒性反应更大。另外，对雄性动物毒性作用更加明显。
4国内外限量要求
2012年7月5日，联合国负责制定食品安全标准的CAC为牛奶中三聚氰胺限量设定了新标准，每千克液态牛奶中三聚氰胺含量不得超过0.15mg。美国、欧盟以及其他国家和组织也设立了各种食品中三聚氰胺MRL标准，见表7-5。总的来说，多数国家将三聚氰胺的限量标准规定为在婴幼儿、孕产妇奶粉中为1mg/kg，其他奶制品中为2.5mg/kg。中国国家食品质量监督检测中心在2008年9月13日指出，三聚氰胺属于化工原料，不允许添加到食品中；10月8日，卫生部、工业和信息化部、农业部、国家工商行政管理总局和国家质量监督检验检疫总局联合发布公告，制定三聚氰胺在奶与奶制品中的临时管理值：婴幼儿配方奶粉中三聚氰胺的限量值为1mg/kg，高于1mg/kg的产品一律不得销售。液态奶（包括原料奶）、奶粉、其他配方奶粉中三聚氰胺的限量值为2.5mg/kg，高于2.5mg/kg的产品一律不得销售。含奶15%以上的其他食品中三聚氰胺的限量值为2.5mg/kg，高于2.5mg/kg的产品一律不得销售。
5样品前处理技术
牛奶、肉、奶粉等动物源性食品样品中富含蛋白质和脂肪，会严重干扰三聚氰胺残留的检测，因此需通过提取、净化、富集等样品前处理技术，除去样品中可能影响检测的杂质组分，以提高检测方法的灵敏度。目前常用的前处理技术有溶剂萃取技术、固相萃取技术、基质分散固相萃取技术、分子印迹技术及免疫亲和色谱净化技术等。
5.1溶剂萃取技术
溶剂萃取是20世纪发展起来的分离技术，其原理是利用溶质在两种互不相溶或者部分互溶的液相之间分配不同的性质来实现目标物的分离或提纯，包括液-液萃取（LLE）和加速溶剂萃取（ASE）等方法，具有选择性高、分离效果好和适应范围广等特点。
三聚氰胺是一种弱碱性化合物，在强酸或强碱环境下可发生水解。三聚氰胺提取在中性、酸性和碱性条件下均可进行，对于食品基质，中性和酸性（pH≤3）条件下提取更为常用。中性条件提取通常使用乙腈-水或者甲醇-水的混合溶液作为提取液。酸性条件提取可选用不同的溶剂及其混合溶液，包括三氯乙酸、甲酸、乙酸、盐酸和三氟乙酸等，其中最常用的为三氯乙酸。三聚氰胺污染的样品一般都富含脂肪和蛋白质，所以在提取前必须进行脱脂和沉淀蛋白质，可先用正己烷和二氯甲烷溶液脱脂，再用三氯乙酸沉淀蛋白质，最后用乙腈来提取三聚氰胺。
但对于三聚氰胺和三聚氰酸的同时检测，目前为了避免三聚氰胺和三聚氰酸的氨基与羟基之间发生聚合反应，形成不溶解的水合物，生鲜乳中三聚氰胺及其类似物测定普遍在酸性或碱性溶液条件下，由水相和乙腈等组成混合提取剂，水相主要包括三氯乙酸溶液、乙酸铅溶液和二乙胺溶液等。乙腈具有一定的沉淀蛋白质作用，可以除去样品中的部分蛋白质，但当乙腈含量过高时，三聚氰酸和三聚氰胺往往容易形成网状聚合物而沉淀，从而降低提取效果，并最终影响回收率和稳定性。朱聪英等通过试验对比了20%二乙胺-乙腈、2%三氯乙酸-乙腈、2.2%乙酸铅-乙腈和乙腈水溶液等提取剂的提取效果。结果表明，在酸性或碱性条件下均有较好的回收率，而用乙酸铅沉淀蛋白质时效果最佳。通过优化提取液比例试验，选用体积比为1∶1的20%二乙胺-乙腈溶液作为提取溶液，并加1mL饱和乙酸铅溶液沉淀蛋白质。
5.2 固相萃取（SPE）技术
SPE是一种基于液相色谱分离机制的样品净化技术，其原理是利用固体吸附剂进行萃取，将液体样品通过填充固体吸附剂的萃取柱，目标物和杂质被吸附而保留在柱上，用选择性溶剂去除杂质，然后再用洗脱液洗脱或加热解吸附，从而达到分离和富集目标化合物的目的。
三聚氰胺是一种弱碱性的化合物，在酸性溶液中可电解为正离子，所以通常用阳离子交换SPE柱（如强阳离子交换、混合模式阳离子交换、聚苯乙烯阳离子交换）进行样品纯化以去除中性和酸性干扰物。目前采用SPE柱在各种基质中选择性提取和浓缩三聚氰胺最为广泛，如SCX-C18混合填料反相色谱柱、Waters Oasis MCX柱和Strata-X-C柱等。蔡勤仁等建立了猪组织中三聚氰胺、三聚氰酸、三聚氰酸一酰胺、三聚氰酸二酰胺及环丙氨嗪的LC-MS/MS检测方法。比较了MCXSPE柱和石墨化碳黑柱的净化效果，结果表明，Sepucol石墨化碳黑柱对5种三聚氰胺类化合物的回收率均能满足要求，MCXSPE柱对环丙氨嗪、三聚氰胺和三聚氰酸二酰胺的回收率最高，但对三聚氰酸和三聚氰酸一酰胺几乎无保留。
洗涤液和洗脱液的种类及应用顺序也会影响三聚氰胺的检测。理论上，对于三聚氰胺的纯化，样品应先用酸性的水溶液洗涤，然后再用甲醇洗脱，这是因为酸性条件有利于三聚氰胺和阳离子基团结合。
虽然SPE具有高效、快速、简便、溶剂耗费少等优点，但在处理大量样品时，仍是一项耗时、耗力的工作。在实际应用时，通常将SPE与其他分析技术联机自动操作，如SPE-HPLC、SPE-LC-MS、SPE-LC-MS/MS等。
5.3基质分散固相萃取技术
基质分散固相萃取是Anastassiades等提出的快速前处理方法，能将样品的提取、净化一步完成，省去了氮吹过程，避免了传统的SPE方法中样品因淋洗、洗脱、转溶、乳化、浓缩造成的待测组分的损失。与传统残留检测方法相比，该净化方法具有回收率高、稳定、简便、快速、经济、环保等优点。
杨玉秀等针对水产品脂肪和蛋白质含量高，成分复杂，含有色素、糖类、有机酸等，采用DSPE的净化方法，较好地去除样品中的杂质，并比较了石墨化碳黑、中性氧化铝和乙二胺-N-丙基硅烷（PSA）3种净化材料。结果表明，石墨化碳黑可有效去除杂质，但对三聚氰胺也有很强的吸附作用，不适合用于水产品中三聚氰胺的净化；中性氧化铝粒径小、表面积大、吸附性强，对水产品中的蛋白质和脂肪有较好的吸附作用，能有效去除干扰成分；PSA含有伯胺和仲胺基团，具有弱的阴离子交换能力，对水产品中有机酸、色素、糖类等均有良好的保留作用。通过试验，选择100mg中性氧化铝与50mgPSA混合使用，其净化效果更佳。
5.4 分子印迹技术（MIT）
MIT是利用具有分子识别功能的分子印迹聚合物（MIP）的一种识别技术，具有类似于抗体的高选择性、高特异性和高柔韧性等优点，适合作为SPE填料或分子印迹薄膜来分离富集目标化合物，达到样品分离纯化的目的。
目前，使用MIP作为固相吸附剂来特异性提取三聚氰胺的研究还比较少。Li等利用环丙三氨三嗪为模板分子，采用甲基丙烯酸、二甲基丙烯酸乙二醇酯和乙腈分别作为功能单体、交联剂和致孔剂来制备特异性识别三聚氰胺的MIP。该聚合物对三聚氰胺最大结合浓度为53.2mmol/mg，将其作为SPE吸附剂提取样品中的三聚氰胺，建立了牛奶和饲料中三聚氰胺的MIT-GC-MS分析方法，其检测限为0.01μg/g，定量限为0.05μ/g，样品添加回收率为93.1%~101.3%。
牛计伟等以三聚氰胺为模板分子，采用沉淀聚合法制备了高选择性和强吸附容量的三聚氰胺的MIP，将其作为SPE吸附剂，与HPLC联用检测奶粉样品中残留的痕量三聚氰胺。结果，萃取回收率为85.1%~99.7%，SPE过程可以避免繁琐的样品浓缩过程，缩短了样品前处理时间，降低了二次污染，可实现大体积样品提取液的直接净化和富集，从而降低了整个检测方法的检出限。
贺利民等以环丙氨嗪为虚拟模板分子、甲基丙烯酸为功能单体、乙二醇二甲基丙烯酸酯为交联剂，采用本体聚合法合成了对三聚氰胺具有良好识别能力的MIP，将其制备成SPE小柱，可有效分离、净化和富集鸡蛋中的三聚氰胺，并结合GC-MS技术测定鸡蛋中的三聚氰胺，方法检出限为10μg/kg，平均回收率为82.8%。
5.5 免疫亲和色谱（IAC）
IAC的原理是将特异性的抗体固定于固相载体上，如琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶等，并装于柱中，然后通过抗原与抗体之间特异性结合来实现样品中目标物的分离净化，同时可对样品中目标物进行浓缩，从而提高检测灵敏度，具有选择性好、操作简单快捷、耗时少、节省试剂等优点，是一种重要的前处理手段。
Zhong等制备了三聚氰胺IAC柱进行受污染食品中三聚氰胺残留的提取和净化，该柱子对三聚氰胺最高结合能力为1 250ng，添加回收率为82.5%~101.4%，变异系数小于10.6%，重复使用次数高达30次，不需要样品前处理即可直接用来提取鸡肉、鸡蛋及奶制品中的三聚氰胺残留。
6检测方法
目前，国内外用于食品中三聚氰胺的检测方法主要是色谱分析法，包括HPLC、LC-MS、GC-MS等；其次是毛细管电泳（CE）、免疫分析法、分子印迹技术、近红外吸收检测法、荧光分析法等。
6.1色谱分析法
色谱分析法是目前使用最广泛的检测方法，具有快速、分离效果好、用量少，且不受样品的限制等特点，特别适用于高沸点、大分子、极性强和热稳定性差的化合物的分析。利用色谱法对三聚氰胺进行测定的报道很多。三聚氰胺的色谱分析检测方法主要有GC、LC、GC-MS和LC-MS等，目前我国国家标准规定的原料乳与乳制品中三聚氰胺检测方法就包括HPLC、HPLC-MS/MS和GC-MS，该方法在原料乳及乳制品中的定量限为2mg/kg。
6.1.1 HPLC
HPLC是目前检测食品中三聚氰胺最常用的方法，国内外报道较多（表7-6）。
将三聚氰胺标准品在200~500nm波长范围内扫描后发现，在236.3nm处测得三聚氰胺的最大吸收，样品中的三聚氰胺在237.4nm处也有最大吸收（图7-13），因此许多报道中多数设定240nm为三聚氰胺的检测波长。
由于三聚氰胺的紫外吸收光谱区低于250nm，当样品制备和色谱条件未达到最优化时容易产生假阳性结果，因此为了增加结果的灵敏度和可信度，常常联合应用DAD系统和荧光反应，检测样品中的三聚氰胺残留。
针对三聚氰胺的化学特性，常用两类色谱柱进行分离：一类是C18和C8柱。三聚氰胺为强极性化合物，在传统的反相色谱中无保留能力，需向流动相中加入离子对试剂与三聚氰胺生成弱极性物质达到分离效果，一般采用缓冲溶液和乙腈为流动相。文献中流动相多数以柠檬酸为缓冲溶液，以庚烷磺酸钠、辛烷磺酸钠、己烷磺酸钠为离子对试剂和乙腈以一定比例混合配制而成。另一类是阳离子交换色谱中的LC-SCX柱或IonPac CS柱。该法常使用磷酸盐缓冲溶液为流动相，在紫外波长240nm处检测，样品的加标回收率、相对标准偏差和重现性都比较好。但磷酸盐缓冲溶液是很好的细菌培养基，在使用过程中会导致溶液浑浊出现菌落沉淀，因此有人用乙酸铵和毒性相对较低的甲醇作流动相代替磷酸盐缓冲溶液。
6.1.2 LG-MS
LG-MS对样品的前处理与HPLC大致相同，但具有较高的灵敏度和较好的重复性，使用MS作为检测器，在一定程度上提高了灵敏度及抗干扰能力，降低了检出限，可以在定性的同时对样品进行定量，因此准确度高、误判的可能性小。
目前LC-MS和LC-MS/MS是定性检测三聚氰胺的最主要方法，国内外相关研究报道较多。Andersen等报道了鱼、虾等动物产品中三聚氰胺和三聚氰酸的LC-MS/MS检测。方法是使用酸性乙腈提取，二氯甲烷去脂，混合阳离子交换SPE柱浓缩富集，采用同位素稀释方法进行定量，平均回收率为63.8%，相对标准偏差为21.5%。Lv等建立LC-MS/MS法检测羔羊肝脏、肾脏组织及血清中的三聚氰胺和三聚氰酸残留。结果表明，在羔羊组织中三聚氰胺和三聚氰酸的检测限分别为10ng/g和20ng/g；在血清中分别为30ng/mL和40ng/mL。赵玉娟等报道了检测饲料中三聚氰胺的LC-MS/MS方法。饲料经10g/L三氯乙酸溶液提取和22g/L乙酸铅溶液沉淀蛋白质，过混合型阳离子交换柱净化，离心后用0.45μm滤膜过滤，用LC-MS/MS分析测定，以三聚氰胺母离子126.9m/z、子离子67.5m/z和84.6m/z定性和定量待测物。饲料样品加标回收率为84.5%，检测限为0.01μg/L，相对标准偏差6.5%。黄优生等建立了快速测定鸡蛋中三聚氰胺残留的HPLC-MS/MS方法。采用阳离子扫描方式（ESI＋）进行分析，以母离子126.9m/z、子离子67.9m/z和84.8m/z定性和定量待测物（图7-14）。该法检测限可达3μg/kg，定量限为10μg/kg，添加样品回收率为87.0%~96.8%。
但是由于三聚氰胺及其同系物为强极性的小分子化合物，在C18键合相色谱柱中几乎无保留。常通过添加离子对试剂，形成反相离子对色谱来解决这一问题，但添加高离子强度的缓冲盐和非挥发性的离子对试剂，不适用电喷雾离子源分析，且反相离子对色谱难以在一次运行中同时分离酸性和碱性物质。测定三聚氰胺常用磺酸基与C18混合填料色谱柱，这种填料色谱柱利用了阳离子交换与反相保留的机理，增加了碱性化合物与极性化合物的保留，它对三聚氰胺类阳离子化合物有很强的保留，但对三聚氰酸则不能保留。对于极性化合物而言，理想的解决方案是采用亲水作用色谱（HILIC）。HILIC机理是极性的待测物在相对非极性的流动相和极性的固定相之间进行分配。在HILIC中，水被吸附在固定相的表面，主要依靠分配作用分离，而非吸附作用。Andersen等用HILIC柱进行LC-MS/MS分析，可对鱼和虾组织中三聚氰胺残留进行定性和定量分析，其检测限为3.2μg/kg。Heller等建立了HILIC/LC-MS/MS法同时检测动物饲料中的三聚氰胺和三聚氰酸。将两性离子对添加到HILIC柱中，在pH梯度变化时可很好地将三聚氰胺和三聚氰酸分离，最低检测限为0.5μg/g。
此外，利用LC-MS对三聚氰胺及其同系物的多残留检测也有报道。何君等建立同时检测大鼠血浆和组织中三聚氰胺和三聚氰酸含量的方法。在选择色谱条件时，在流动相中加入离子对试剂，采用体积比为9∶1的乙腈水溶液，并混有5mmol/L的乙酸铵和0.1%乙酸的流动相，以改善其在反相柱上的保留行为，同时加入甲酸提高离子化效率，使得三聚氰胺在色谱柱上能够较好保留；MS条件采用ESI离子源、SIM模式，并采用按运行时间段切换正、负离子模式，三聚氰胺采用正离子模式，三聚氰酸采用负离子模式，得到了较好的色谱峰和较高的灵敏度。简龙海等为避免使用ESI源产生基质抑制效应而导致灵敏度差的问题，采用APCI源同时进行尿液中三聚氰胺和三聚氰酸的测定，基质抑制效应可明显改善，三聚氰酸和三聚氰胺的灵敏度明显增强。蔡勤仁等建立了猪组织中三聚氰胺、三聚氰酸、三聚氰酸一酰胺、三聚氰酸二酰胺及环丙氨嗪的LC-MS/MS检测方法。进行了色谱条件选择和MS条件优化试验，结果表明，Waters Atlantis HILIC柱分离效果最好，并通过洗脱梯度的调节，将正负两组离子分开，采用正负离子切换的扫描方式（表7-7），灵敏度和峰形良好，方法检出限为2μg/kg，回收率为94.2%~99.9%，相对标准偏差为3.8%~7.5%。
6.1.3 GC-MS
GC-MS也常用来定量检测和确证三聚氰胺及其类似物。由于三聚氰胺及其类似物均是沸点较高的极性化合物，且均含有—OH、—NH2等极性官能团结构，难汽化，直接采用LC进行分离较为困难，不但灵敏度低且峰拖尾严重。为改善各组分LC性质，在进行仪器检测前必须对样品进行衍生化处理。
1987年，Toth等首先报道用GC-MS法来检测环丙氨嗪及其代谢物三聚氰胺。Zhu等也采用GC-MS法同时定量和确证动物源性食品中环丙氨嗪和三聚氰胺残留。样品制备时首先用酸性的乙腈或水溶液提取，然后将鸡肉或鱼肉用二氯甲烷脱脂，鸡蛋或牛奶样本用3%三氯乙酸萃取，而后提取物经MCX柱纯化，进样前用N，O-双（三甲基硅烷基）三氟乙酰胺衍生。肌肉组织中检测限为10μg/kg，牛奶和鸡蛋中检测限为5μg/kg。
王征采用N，O-双（三甲基硅烷基）三氟乙酰胺衍生化，极性的减弱使其容易汽化，有利于待测物和基质的分离，降低了背景化学噪声的影响。王立媛等用GC-MS法检测奶粉和鲜奶中三聚氰胺，加标回收率为82.3%~110.0%，相对标准偏差小于10%，方法净化效果好、准确度高、灵敏度好、重现性高。吕燕等建立了鸡蛋中三聚氰胺残留检测的GC-MS方法。采用三氯乙酸、乙酸铅混合溶液提取鸡蛋中三聚氰胺，经混合型阳离子交换固相萃取柱（Cleanert PCX，60mg/3mL）净化后衍生，生成稳定的衍生物后用GC-MS仪检测。方法灵敏度高，最低检测限为5μg/kg，回收率为72.31%~99.87%，相对标准偏差不大于11%。
但是GC-MS法需要进行衍生化，样品处理步骤复杂、过程不易控制，不适用于多杂质生物检材中三聚氰胺的快速筛查和定量分析，不能满足快速大批量检测的需要。针对此问题，李东刚等利用离子阱GC-MS仪，建立了非衍生化-GC-MS/MS直接分析饲料中三聚氰胺的方法。利用三聚氰胺的二级质谱进行定性，以二级质谱的特征离子峰m/z 85进行定量，方法的精密度为5.9%，回收率为87%~98%，可满足饲料中三聚氰胺检测的限量要求。
朱聪英等建立了用GC-MS同时检测三聚氰胺、三聚氰酸、三聚氰酸一酰胺、三聚氰酸二酰胺的方法。为改善各组分GC性质，样品经BSTFA衍生化后，所含氨基、羟基上的氢均可被三甲基硅烷（TMS）所取代，形成含有3个硅烷基结构的衍生物（Tri-TMS），此时的色谱行为良好。衍生化后的4种化合物的质谱图见图7-15。三聚氰胺、三聚氰酸、三聚氰酸一酰胺、三聚氰酸二酰胺衍生物的特征离子分别是（m/z 342、327、171、285）、（m/z 345、330、100、147）、（m/z 344、329、171、100）和（m/z 343、328、171、285），其定量离子分别是m/z 327、345、344、343。
6.2 CE
CE又称为高效毛细管电泳（HPCE），是一种以毛细管为分离通道、高压直流电场为驱动力，依据样品中各组分间电荷大小和亲水性的差异而实现分离的技术。CE具有样品用量少、分析成本低、分离效率高和基质干扰程度低等优点，被广泛用于各个领域，用HPCE分析三聚氰胺的研究已有不少报道。
与HPLC法相比，HPCE法兼有电泳和色谱双重技术的特点。HPCE分离效率比HPLC法高，且分离迅速，经相同前处理后，HPCE法比HPLC法对三聚氰胺的分离效果更好；HPCE法样品消耗量比HPLC少；HPCE比HPLC经济环保，HPLC使用的色谱柱价格是毛细管柱价格的几倍。此外，HPLC分析一个样品时，时间越长消耗流动相越多，不仅价格昂贵，而且给环境造成严重的危害。而用HPCE检测一个样品只需1mL缓冲溶液，价廉易得，对环境几乎无污染。但是由于HPCE进样量少、毛细管柱内径小、光程短（CE检测窗口仅为液相检测池的1/20），它的灵敏度受到严重限制，且稳定性也有待提高，所以常规CE检测痕量三聚氰胺还有一定的局限性，只能用于含量较高的样品分析。饶钦雄等利用CE检测鸡蛋中三聚氰胺分离时间约6min，测得的定量限为0.25mg/kg。
为了提高检测灵敏度，常将CE与UVD、DAD等联合进行食品中三聚氰胺残留的痕量检测。Cernova等采用CE-UCD对奶粉中的三聚氰胺进行快速检测，其检测限可达到0.06μg/mL。Yan等提出用CE-DAD检测奶制品、鱼饲料和鱼肉等多种样品中的三聚氰胺残留。Chen等运用CE也建立了一种可同时检测牛奶中三聚氰胺和5-羟甲基呋喃甲醛的灵敏、简单和可靠的分析方法。该方法将CE和DAD联用，在检测系统中添加十二烷基磺酸钠作为筛选介质以增加分离效率。结果表明，根据迁移时间和紫外吸收光谱的不同可实现三聚氰胺和5-羟甲基呋喃甲醛的同时检测，其检测限分别为0.047μg/mL和0.067μg/mL，与HPLC法相比具有分辨率高、分析时间短、所需样品量少、分离效率好等优点。Xia等将毛细管区带电泳（CEZ）法联合二极管陈列检测器（CZE-DAD）建立了一种简单、快速、准确并可同时检测鸡蛋、宠物饲料和奶制品中的三聚氰胺及其类似物的方法。
有报道，与HPLC、荧光光度法和常规的CZE等方法相比，场放大进样-曲带毛细管电泳（FESI-CZE）具有以下明显优势：①灵敏度高。利用在线富集技术可使灵敏度提高近3个数量级，弥补了CE-UVD在测量灵敏度上的缺陷。②抗干扰能力强。在电渗流被抑制的情况下采用电进样方法，对进入毛细管中的成分具有选择性，进样时样品通过电泳作用力引入毛细管中，在正向进样电压下，仅阳离子化合物能进入毛细管中，而基质中一些中性分子或阴离子化合物不能进入或只能少量进入毛细管中，从而克服了样品中存在的部分干扰。③运行成本低，经济环保。利用FESI-CZE技术的优势，李娟等建立了基于水塞联用FESI的CZE检测多种样品中三聚氰胺的分析方法。试验条件：水塞组成为40%乙腈和60%水，水塞进入时间200s，进水压力3kPa。以120mmol/L NaH2PO4缓冲液（pH2.2）-10%甲醇为运行缓冲溶液，以0.10mmol/L NaH2PO4缓冲液（pH2.2）-20%乙腈为样品基体溶液，进样电压20kV，进样时间80s，分离电压20kV。通过在水塞后电动大体积进样可提高UVD的灵敏度，且采用电动进样，对进入毛细管中的样品具有选择性，样品基质中的一些杂质不能进入柱内，能较好地克服样品基质的影响。在优化试验条件下，与普通的CZE法比较，三聚氰胺的紫外检测灵敏度提高了800倍（图7-16），检出限由2.0mg/L降至2.5μg/L，线性范围为10~1 000μg/L，添加样品回收率为98%~106%，相对标准偏差均不高于5.1%。
6.3免疫分析法
免疫分析法在食品安全检测中应用广泛，常被用作快速筛选方法。免疫学法是一种快速检测三聚氰胺的方法，其原理是利用萃取液通过均质及振荡的方式提取样品中的三聚氰胺并进行免疫测定。该法优点是操作简便、分析速度快、可大批量筛选；缺点是与分析样品类似的结构物也可与特异性抗体发生反应，从而产生干扰，在检测过程中存在假阳性问题，对阳性样品需确证方法进行确证。
三聚氰胺事件后，国内外开始研究三聚氰胺完全抗原的合成、多克隆抗体及单克隆抗体的制备等工作。由于三聚氰胺相对分子质量仅为126，是典型的小分子半抗原，用制备的三聚氰胺人工抗原来刺激机体免疫系统产生特异性抗体。首先需要选择合适的三聚氰胺结构类似物作为半抗原进行衍生化，然后采用合适的偶联方法将其与载体蛋白连接得到完全抗原，关键在于不能破坏其表面结构和保持最小的能量转移，这对制备出高灵敏度、高特异性和稳定性的三聚氰胺抗体是至关重要的。目前主要有ELISA法和胶体金免疫层析法。
考虑到三聚氰胺具有环状对称的特殊结构，有3个氨基可供偶联载体，如果采用氨基的反应直接与蛋白连接，则3个氨基都可以同载体蛋白偶合，导致三聚氰胺完全被大分子蛋白包围，这样的抗原不能刺激产生高效价抗体。采用控制三聚氰胺和琥珀酸酐等量反应摩尔比的方法，只将其中1个氨基连接上带有羧基的4碳间隔臂以合成完全抗原。
Wang等建立了一种间接竞争ELISA法，可用于检测猪和鸡的组织及体液中三聚氰胺残留，检测限为50ng/mL，同时用GC-MS法确证，两种方法显示出很好的相关性。Lei等以碳二亚胺法合成三聚氰胺完全抗原，并免疫动物得到特异性多克隆抗体，建立了特异性检测三聚氰胺的间接竞争ELISA法，检测限为5.2ng/mL，定量限为7.6ng/mL。Liu等首先对三聚氰胺进行衍生化合成完全抗原，并免疫动物得到了三聚氰胺的多克隆抗体，建立ELISA法，并对动物肌肉组织中三聚氰胺残留进行检测，检测限为1.8ng/g，样品添加回收率为84.6%~94.3%。
Yin等制备了抗三聚氰胺单克隆抗体，并建立了检测牛奶、奶粉和动物饲料等样品中三聚氰胺残留的间接竞争ELISA法，实际样品检测限牛奶中为0.1mg/L、奶粉中为0.2mg/kg、饲料中为0.5mg/L，添加回收率为79%~110%。何方洋等利用三聚氰胺类似物与载体蛋白偶联合成免疫原及包被原，免疫BALB/c小鼠，制备了抗三聚氰胺的单克隆抗体。蔡家利等也成功制备了抗三聚氰胺单克隆抗体，检测限为0.15μg/mL，定量限为4.15μg/mL，除与三聚氰酸交叉反应率为72%外，与三嗪类药物及其他抗菌药物等交叉反应率均小于5%。
目前，采用胶体金免疫层析法对三聚氰胺进行检测的研究很少。Li等建立了食品中三聚氰胺残留检测的胶体金免疫层析法，原料乳检测限为0.05μg/mL，动物饲料和奶粉检测限为1μg/g，其他奶制品检测限为2μg/g，整个检测过程在3~10min完成。
6.4分子印迹技术
分子印迹技术是近年发展起来的一种新方法，可为人们提供具有期望结构和性质的分子聚合体。目前，新型的光响应分子印迹材料成为科研学者关注的热点。这类功能化分子印迹材料通常是将偶氮苯作为功能单体引入分子印迹材料而制得的。由于偶氮苯化合物在光照下能在顺反两种构型之间可逆地进行转变，即在紫外光的照射下，偶氮苯由反式变为顺式；在热作用或可见光条件下，偶氮苯由顺式回到反式，因此在光响应性分子印迹材料中，作为特异性结合位点而存在的偶氮苯基团在光照下能够发生异构，引起MIP材料中特异性结合空腔的巨大变化，从而导致主-客体结合能力的改变。
聂颖恬将分子印迹与偶氮苯光响应单体相结合，制备了含有偶氮苯光响应性功能单体的分子印迹水溶胶，该材料能在光照下实现对三聚氰胺分子的可控吸收和释放。此外，三聚氰胺在特异性结合空腔中与偶氮苯功能单体发生相互作用，能影响偶氮苯功能单体异构化速率，偶氮苯单体异构化速率改变的大小和三聚氰胺的浓度有关，基于此构建了一种新型的三聚氰胺快速检测法，能准确检出奶样中三聚氰胺的含量，前处理方便，测试过程快速，准确性较好，检测限可达0.25mg/kg。
Pietrzyk等以三聚氰胺为模板分子、bis（2，2’-bithienyl）-benzo-[18-crown-6]methane为功能单体、3，3′-bis[2，20-bis（2，20-bithiophene-5-yl）]thianaphthene为交联单体，通过电聚合方式制备出三聚氰胺MIP膜，建立了基于MIP膜的三聚氰胺化学传感器分析法，其检测限为5×10－9mol/L，检测线性范围为5×10－9~1×10－3mol/L。
Liang等也建立了基于MIP的电位传感器方法用于牛奶中三聚氰胺残留检测。以甲基丙烯酸为功能单体、二甲基丙烯酸乙二醇酯为交联单体制备MIP，然后联合离子选择电极检测牛奶中三聚氰胺，其检测限为6.0μmol/L。
6.5近红外吸收检测法
在三聚氰胺的分子结构中，3个C原子分别与2个N原子和1个-NH2连接。虽然C-N键的谱峰很难识别，但是-NH2的波动却是正好处于近红外区域，因此可以对三聚氰胺进行近红外分析。该方法的原理是用一种特定波长的近红外线照射被检样品，根据样品中三聚氰胺对红外线的吸收强弱来实现其含量的实时监测，该法是一种无接触、无损伤和无危害的检测方法。对于三聚氰胺而言，其含量越高所反射出的光线强度就越弱。同时该法预先扣除了蛋白质中-NH2含量的影响，选择性相对较好。
徐云等结合光谱预处理和波长选择及模型优化方法建立了测定牛奶中三聚氰胺含量的近红外定量分析模型，具有较好的稳定性和重复性（相对标准偏差小于10%）。但该法设备价格昂贵，需要不断进行校准，不同样品基质中的干扰是近红外分析精度及重现性的一大障碍。
6.6荧光分析法
三聚氰胺是一种三嗪类含氮杂环有机化合物，其分子中含有共轭双键（π键）结构及3个取代基-NH2，其激发态由环外氨基上的n电子激发转移到环上而产生。由于它们n电子的电子云几乎与芳环上π轨道平行，因而实际上它们共享了共轭π电子结构，扩大了其共轭双键体系，故具有荧光特性，在非极性的介质中，它的荧光较弱，随着介质极性的提高，其荧光强度也随之增大，当它处于酸性介质中时，取代基-NH2会质子化为-NH＋，荧光强度明显减弱，甚至无荧光发生；而在弱碱性介质中，其荧光强度明显增强。
黄晖等利用三聚氰胺的荧光特性建立了用荧光分光光度法测定牛奶中三聚氰胺的方法。利用弱碱性介质中阳离子表面活性剂十六烷基三甲基溴化铵（CTMAB）对三聚氰胺荧光强度的增敏作用，在pH8.00的Tris-盐酸缓冲溶液中，以CTMAB为增敏剂，用荧光光度计测定三聚氰胺，线性范围为25~1000μg/L，检出限为19μg/L，相对标准偏差为1.6%。
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