【科学背景】
聚合物纳米颗粒（NPs）由于其生物降解性，生物相容性以及高度可定制的药物加载和释放能力而被广泛用于生物医学应用。尽管有许多关于NP力学对纳米生物相互作用（例如内在化，吸收，运输和降解）影响的报道，但在与聚合物NP利用率相对应的条件下，还没有系统地表征聚合物NP力学。这种缺陷的根源在于，尽管原子力显微镜（AFM）非常适合表征纳米级材料（即NP），但在生理条件下（例如，缓冲液中的37°C）进行的实验具有挑战性，需要专用设备。虽然可以使用大量测量值来推断NP的机械性质以了解生物学功能，但这种推断所依据的假设是，悬浮在缓冲液中并加热至生理温度不会显着改变NP的力学。这种假设适用于某些无机NP，例如由金属和氧化物组成的那些。此外，对具有不同机械性能的二氧化硅纳米胶囊的系统研究发现，吞噬作用和靶向肿瘤的过程对纳米颗粒的硬度有很强的依赖性。
【科研摘要】
尽管可生物降解的聚酯纳米粒子广泛用于药物递送，并且有报道称纳米粒子力学对纳米生物相互作用具有强大的影响，但在生理相关条件下，对这些纳米粒子的力学却缺乏系统的研究。最近，波士顿大学Keith A. Brown教授团队报告使用原子力显微镜对聚乳酸和聚丙交酯乙交酯纳米颗粒的压痕实验。虽然发现干燥的纳米颗粒在室温下是刚性的，但是发现它们的弹性模量在模拟的生理条件下（即在37℃的水中）降低了多达30倍。差示扫描量热法证实该软化可归因于纳米颗粒的玻璃化转变。结合机械和热分析特性，研究了微型化，分子量和浸入水中的塑化效果。总的来说，这些实验为实验家们探索聚合物纳米粒子力学与体内行为之间的关系提供了见识。
【图文解析】
在典型的压痕实验中，如先前报道的那样，通过纳米沉淀合成了NP，然后将其滴铸在涂有聚-1-赖氨酸（PLL）的盖玻片上，以促进NP与底物的粘附。对于在水中进行的压痕实验，在整个合成，制备和实验过程中，将NP浸入Milli-Q水中。在压痕实验中使用水代替缓冲液以避免NP脱离。为了进行机械表征，将盖玻片放在AFM系统内的Peltier加热元件上，并保持在固定的实验温度下。然后，使用AFM在敲击模式下扫描表面以识别没有NP的区域，以进行探针校准程序，然后再次扫描表面以识别分离的NP以进行机械表征（图1a）。然后在分接模式下收集所选NP的高分辨率图像，以精确识别其顶点（图1b）。定位颗粒顶点之后，对颗粒进行压痕以产生力-压痕曲线（图1c），该曲线与修正的Hertzian接触模型拟合，该模型考虑了NP直径d（估计为颗粒的高度）和AFM探针直径，以NP宽度w和d之差来衡量（图1d）。
图1.使用原子力显微镜（AFM）表征纳米颗粒（NP）的典型实验程序。（a）低分子量聚乳酸（PLALMW）NP集合的调查图像（高度通道），以识别孤立的NP（虚线框）。彩色条表示高度。（b）从（a）中选择的孤立NP的高分辨率AFM图像的高度通道，以及穿过NP顶点的虚线。颜色表示（a）中颜色栏后面的高度。（c）（b）中NP的力曲线，力F与压痕h的关系。粗绿线表示从中导出弹性模量E的接触模型拟合。（d）AFM探针（白色）扫描位于基材（灰色）上的NP（绿色）时的示意图。黑色粗线是（b）中虚线所示的切割线。 表观颗粒宽度w和来自成像的测得NP直径d用于估计AFM探针直径以进行分析。
为了区分在干燥条件下区分大样本和在模拟生理条件下区分NP的不同因素的贡献（图2a，b），对模型聚合物，低分子量PLA（PLALM，分子量Mw 18–28 kDa，特性粘度0.25–0.35 dL/g）。首先，通过滴铸PLALMW在乙腈中的溶液并使其在真空下干燥一个月来制备3mm厚的PLALMW膜。然后在25°C下使用球形AFM探针（半径= 920 nm）压入干燥的块状薄膜。块状聚合物薄膜的最终弹性模量E为4.7±0.5 GPa，与文献值相吻合（图2c）。
图2.在生理条件下进行实验时，区分本体聚合物与NP的因素。（a）与（b）固定在聚-1-赖氨酸处理的玻璃盖玻片上的聚合物NP的AFM高度图相比，干散装聚合物的示意图。（c）块状聚合物薄膜中PLALMW的测得模量E，在空气中测得的NPs，在水中测得的NPs以及在高温下在水中测得的NPs，每个条形图上都标明了实验次数（n）。（d）水和空气以及大块PLALMW粉末中PLALMW NP的差示扫描量热（DSC）热分析图。
有趣的是，压痕实验得到的E表明，尽管两种材料都在水的存在下发生了软化，但吸湿性更高的聚合物PLGA受到的影响更大（图3a）。为了探索分子量在NP力学中的作用，对分子量为209 kDa，特性粘度为1.3–1.7 dL/g的高分子量PLA（PLAHMW）NP进行了一系列压痕实验。由于分子链长度的增加，如Flory-Fox关系所预测的，PLAHMW的所有条件（水中的NPs，空气中的NPs和散装粉末的Tg）都高于PLALMW的相应条件Tg。虽然在浸泡水中观察到PLAHMW NP Tg降低，与PLALMW观察到的Tg变化相当，但Tg仍高于37°C。这些压痕实验证实，即使在生理温度下，水中的PLAHMW NP也呈玻璃态（图3b）。
图3.（a）25°C时水对PLALMW和聚丙交酯-乙交酯共聚物（PLGA）的NP E的影响。橙色条形图表示在空气中测得的NP的测得E，蓝色表示在水中测得的NPs。（b）分子量对PLALMW和高分子量PLAHMW的NP E的影响，在空气中25°C（橙色阴影线图）和在水中37°C（蓝色阴影线图），其中n表示为每个条形图。
水中的纳米力学表征复杂化，因为NP之间的附着力以及在水中的下层底物比在空气中的附着力低，通常导致颗粒的拖曳和积聚。尽管颗粒的拖曳和积累可能使识别单个颗粒变得困难，但是一旦在适当的成像条件下识别了这些颗粒，就可以对其进行可靠的表征。然而，在空气中进行纳米机械表征的挑战较少，在这种情况下，毛细管效应使颗粒较不易发生尖端运动。因此，作者研究了在空气中观察橡胶状NP力学的能力。为此，对PLALMW和PLGA在高于干燥NP Tg的温度T进行了压痕实验。具体而言，为PLALMW和PLGA选择的T值分别为49.4和48°C，表示空气中NPs Tg上方的温度变化ΔT与在水中和37°C下为NPs测量的Tg之差相称。有趣的是，对高于其Tg的干燥NP进行的压痕实验产生的E值在GPa范围内（图4a），这表明NP仍处于玻璃态，即使DSC结果表明T> Tg。
图4.空气中高温下的压痕实验。（a）空气中PLALMW（顶部）和PLGA（底部）NP的测量E。绿色实心数据点表示AFM载物台设定点温度TS。虚线代表空气中每个NP的峰值玻璃化转变温度Tg。对于两个面板中最右边的数据点，垂直上边界代表与修改后的Hertzian模型拟合，而垂直下边界则代表基于JKR的模型。（b）由AFM探针测得的温度TP与TS的关系图，在水（黑色）中以0.9×TS 3.1°C进行相应的线性拟合（虚线），在空气（白色）中以相应的线性拟合（虚线）进行采集0.5×TS 10.7°C。空气中实验的斜率用于确定（a）中水平误差线的最左边界，以说明AFM尖端冷却。（c）AFM探针使水和（d）空气中的NP缩进的示意图，其中加热来自盖玻片底物下方的平台（用红色箭头表示）。
为了解释当T> Tg时NP的明显玻璃态，作者假设AFM探针在压痕过程中正在冷却空气中的NP。为了研究这种潜在的热传递，使用一系列功率谱密度（PSD）测量和等分定理，通过改变AFM台设定点温度TS来测量AFM探针温度TP。当探针浸入水中时，其斜率TP与TS的线性拟合为0.9±0.3（65％置信区间）（图4b），这表明来自载物台的热量已通过水有效地传递到探头。验证探头的冷却现象对于在空气中升高的温度下进行压痕实验至关重要。即，这表明当与AFM探针和底物都接触时，NP不是等温的（图4c，d）。这一发现尤其适用于NP的内部热梯度在Tg以下至Tg以上的实验，这表明该颗粒部分处于玻璃态，部分处于橡胶态。NP中的刚度梯度可能会以任何现有接触模型无法准确捕获的方式改变接触行为。尽管这些结果表明，在解释空气中升高的温度下的机械测量结果时要格外谨慎，但探针和样品温度在水中的良好对应关系表明，这种伪影在水中不存在。
参考文献：
doi.org/10.1021/acs.nanolett.0c03004
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