根据游戏背景，纽约市地下管道里四只功夫高强的忍者神龟和他们的老师斯普林特，为了保卫城市家园，同狡猾的巴克斯特·斯多克曼博士、紫龙帮的坏蛋以及一伙神秘且训练有素的忍者（史莱德的部下）展开殊死搏斗。
这四只神气十足的小乌龟，有手执忍者刀的、武士棒的、双截棍和钢叉的，英勇团结，不畏邪恶，与反派斗争着，性格也迥然各异，它们以知名艺术家、科学家的名字命名（是当时老鼠老师以文艺复兴时期四位大师的名字命名的），分别是他们的领导者达芬奇、暴躁冲动却富有激情的拉斐尔，最爱搞笑的米开朗基罗和个性沉稳的多纳泰罗。
游戏人物的哲学—达·芬奇（蓝龟）：从需要一个领导开始，就去尽力去做大家的领导，是一个对管理者感兴趣的乌龟。非常注重忍术，因此努力去训练自己，时常也会读一些兵法的书籍，在我的家人需要的时候，为他们尽一份力。
拉斐尔（红龟）：是个“堕落”的、愤世嫉俗的悲观者，很容易发火的年轻人！讨厌主动挑衅别人，但如果有人来惹我，我一定会让他们好看！
米开朗琪罗（橙龟）：算是一个自恋狂，也是一个享受生活乐趣的乌龟，乐趣恒生，生活是自己创造的，所以要活得痛快！幸福只是生活的过程，而不是目的地。
多纳泰罗（紫龟）：是神龟中的天才。喜欢独立思考，乐于助人。有很多做不完的事情，感觉时间总是不够用。是一个掉链子的忍者战士，也是一个和平主义者！但不幸的是，命运往往不会让你来选择！
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