第一章 基因工程
第一节 基因工程概述
一．基因工程的概念
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操作环境 |
操作对象 |
操作水平 |
基本过程 |
结果 |
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生物体外 |
基因 |
分子水平 |
剪切→拼接→导入→表达 |
人类需要的基因产物 |
由于基因工程是在DNA分子水平上进行操作,因此又叫做重组DNA技术。
二．基因工程的基本工具
（一）“分子手术刀”——限制性核酸内切酶（简称限制酶）
1．来源：主要是从原核生物中分离纯化出来的。
2．功能：能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两
个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。
3．结果：经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式：黏性末端和平末端。
（二）“分子针线”——DNA连接酶
1．分类：根据酶的来源不同，可分为E·coliDNA连接酶和T4DNA连接酶两类
2．功能：恢复被限制酶切开了的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。
★两种DNA连接酶(E·coliDNA连接酶和T4DNA连接酶)的比较：
①相同点：都缝合磷酸二酯键
②区别：E．coIiDNA连接酶来源于大肠杆菌，只能使黏性末端之间连接；
T4DNA连接酶能缝合两种末端，但连接平末端之间的效率较低。
★DNA连接酶与DNA聚合酶作用的比较
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DNA连接酶 |
DNA聚合酶 | ||
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不同点 |
连接的DNA |
双链 |
单链 |
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模板 |
不要模板 |
要模板 | |
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连接的对象 |
2个DNA片段 |
单个脱氧核苷酸加到已存在的单链DNA片段上 | |
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相同点 |
作用实质 |
形成磷酸二酯键 | |
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化学本质 |
蛋白质 | ||
(三) “分子运输车”——载体
1.载体具备的条件：
①能在受体细胞中复制并稳定保存；
②具有一至多个限制酶切割位点，供外源DNA片段插入；
③具有标记基因，供重组DNA的鉴定和选择。
2.基因工程常用的载体有： 质粒 、 噬菌体 和 动、植物病毒 等。
最早应用的载体是质粒，它是细菌细胞中的一种很小的双链环状DNA分子。
三．基因工程的基本过程
(一) 获得目的基因（目的基因的获取）
1.获取方法主要有两种：①从自然界中已有的物种中分离出来，可从基因文库中获取。
②用人工的方法合成。
★获得原核细胞的目的基因可采取直接分离，获取真核细胞的目的基因一般是人工合成。
★人工合成基因的常用方法有反转录法和化学合成法。
2.利用PCR技术扩增目的基因
（1）PCR的含义：是一项在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。
（2）目的：获取大量的目的基因
（3）原理：DNA双链复制
（4）过程：第一步：加热至90～95℃DNA解链为单链；
第二步：冷却到55～60℃，引物与两条单链DNA结合；
第三步：加热至70～75℃，热稳定DNA聚合酶从引物起始进行互补链的合成。
（5）特点：指数形式扩增
(二) 制备重组DNA分子（基因表达载体的构建）
1．重组DNA分子的组成：除了目的基因外，还必须有标记基因。
★标记基因的作用：鉴定受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。
2．方法：同种限制酶分别切割载体和目的基因，再用DNA连接酶把两者连接。
(三) 转化受体细胞（将目的基因导入受体细胞）
1.转化的概念：是目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。
2.常用的转化方法：
①将目的基因导入植物细胞：采用最多的方法是农杆菌介导转化技术（农杆菌转化法），其次还有基因枪介导转化技术（基因枪法）和花粉管通道技术（花粉管通道法）。
②将目的基因导入动物细胞：最常用的方法是显微注射技术。此方法的受体细胞多是受精卵。
③将目的基因导入微生物细胞：Ca＋处理法。
(四) 筛选出获得目的基因的受体细胞、培养受体细胞并诱导目的基因的表达（目的基因的检测与鉴定）
1.首先要检测转基因生物的染色体DNA上是否插入了目的基因，方法是采用DNA分子杂交技术。
2.其次还要检测目的基因是否转录出mRNA，方法是采用DNA分子杂交技术。
3.最后检测目的基因是否翻译成蛋白质，方法是采用抗原—抗体杂交技术。
4.有时还需进行个体生物学水平的鉴定。如抗虫或抗病的鉴定等。
第二节 基因工程的应用
1．运用基因工程改良动植物品种最突出的优点是：能打破常规育种难以突破的物种之间的界限。
2．基因工程的应用
（1）植物基因工程：抗虫、抗病、抗逆转基因植物，利用转基因改良植物的品质。
（2）动物基因工程：提高动物生长速度来提高产品产量、改善产品品质，用转基因动物生产药物，用转基因动物作器官移植的供体等。
（3）基因诊断和基因治疗：
基因诊断：又称为DNA诊断，是采用基因检测的方法来判断患者是否出现了基因异常或携带病
原体。
基因治疗：指利用正常基因置换或弥补缺陷基因的治疗方法。
实例：ADA基因缺陷症的基因治疗
第三节 蛋白质工程
1．蛋白质工程的实质：根据蛋白质的结构与功能之间的关系，通过改造基因，以定向改造天然蛋白质，甚至创造自然界不存在的、具有优良特性的蛋白质。
2．蛋白质工程的基本原理
预期蛋白质功能→测定蛋白质三维空间结构→推测应有的氨基酸序列→找到对应的脱氧核苷酸序列（基因）→具有预期功能的蛋白质
3.蛋白质工程的应用
（1）通过改造酶的结构，有目的地提高蛋白质的热稳定性。
（2）合成嵌合抗体。
（3）改变蛋白质的活性。
★蛋白质工程与基因工程区别
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蛋白质工程 |
基因工程 | |
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实质 |
通过改造基因，以定向改造天然蛋白质，甚至创造自然界不存在的蛋白质 |
将目的基因从供体转移到受体细胞，并在受体细胞中表达 |
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结果 |
合成自然界不存在的蛋白质 |
只能生产自然界已存在的蛋白质 |
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联系 |
蛋白质工程是在基因工程基础上，延伸出的第二代基因工程 | |
