作者：米粒儿
克罗恩病是一种原因不明的肠道炎症性疾病，今天跟大家分享的这篇论文主要关注克罗恩病。揭示缺氧环境对肠道炎症保护的分子机制。缺氧调节自噬和核苷酸结合低聚体结构域类似受体热蛋白结构域(NLRP)3，本文作者证明缺氧可通过自噬途径和(mTOR)/NLRP3通路减轻结肠炎发病过程中的炎症。
缺氧可显著性的降低肿瘤致死因子α，白介素-6和NLRP3表达，并且提高自噬蛋白p62翻转。在体外，缺氧引发的自噬降低NF-κB和NLRP3的表达。同时，作者也证明NLRP3可作为mTOR的结合蛋白。
二甲基草酰甘氨酸 调节的羟化酶抑制可改善小鼠结膜炎，下调NLRP3，促进自噬。因此可发现，缺氧通过降低mTOR和 NLRP3的结合以及激活自噬减轻炎症。
下边我们看一下作者是如何得到这些结论的。
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缺氧降低克罗恩病人体内炎症相关基因表达
为了研究缺氧环境对结肠炎症的影响，作者模拟了海拔4000m的缺氧环境，并将正常人和炎性肠疾病患者暴露于以上缺氧环境3h后。结果显示克罗恩病患者体内NLRP3和TNFα表达量明显升高，而IL-1β和IL-6的mRNA水平并未见显著变化。而溃疡性结肠炎患者中未见此效应（Fig.1a-d）。
缺氧处理后（1周/2周）后，NLRP3，TNFα和IL-6的mRNA水平显著降低。而且缺氧造成的炎症相关因子降低现象与自噬相关p62表达升高同时发生（Fig.1e）。免疫组化结果也显示缺氧处理后p62表达显著改变。
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缺氧可降低葡聚糖硫酸钠诱导的炎症基因表达
为了进一步验证缺氧环境对炎症影响和NLRP3在缺氧调节中的作用，WT和NLRP3-/-小鼠经2%葡聚糖硫酸钠（DSS）处理后，暴露于常氧或者缺氧环境18h。葡聚糖硫酸钠（DSS）处理后，WT和NLRP3-/-小鼠体内炎症调节因子TNFα，IL-6，IL-1β，NLRP3的mRNA水平升高（Fig.2a-d）。
而经缺氧处理后，TNFα，IL-6，IL-1β，NLRP3的mRNA水平在WT小鼠中显著降低，而在NLRP3-/-小鼠中未见明显改变。该结果证明，NLRP3在缺氧调节的抑制作用中发挥重要作用。同时，缺氧也可诱导WT和NLRP3-/-小鼠中自噬相关蛋白p62和LC3的表达（Fig.2f-g）。
采用缺氧marker VEGF的表达来确认实验中的缺氧环境。在常氧环境中，DSS处理的小鼠中，NF-κB 亚基p65/RelA磷酸化水平与p62表达量同时提高（Fig.2h）。在WT小鼠中，缺氧能够逆转DSS诱导的p65//RelA磷酸化和NLRP3表达。
并且可以降低mTOR磷酸化水平，p62的降解，增加LC3-II/LC3-I，从而修复细胞自噬（Fig.2h）。有意思的是，NLRP3-/-小鼠中，mTOR磷酸化水平降低，并且对缺氧环境无响应，说明NLRP3在自噬调控中的作用。
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在IL-10-/-小鼠中缺氧导致炎症基因表达降低
接下来，我们试图确认在小鼠直肠炎模型IL-10-/-中确认缺氧对抗炎症效应的影响，WT，IL-10-/-，Nlrp3-/-和IL-10-/-/Nlrp3-/-双敲除的小鼠模型分别暴露于常氧/缺氧环境中18h。在常氧环境中，IL-10-/-小鼠中TNFα, IL-6, IL1β 和 Nlrp3的mRNA水平表达上升，而在缺氧环境中表达下降，同时p62表达也上升（Fig3a-f）。缺氧环境中LC3的mRNA水平也上升（Fig3g）。
在常氧环境中，与lrp3-/-和IL-10-/-/Nlrp3-/-双敲除的小鼠模型相比，IL-10-/-小鼠中，p65/RelA磷酸化，mTOR磷酸化，p62和LC3的水平都有所上升（Fig3h）。这一结果提示
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在IECs中，缺氧导致NLRP3降解和自噬激活
接下来，作者试图揭示缺氧对结肠粘膜的保护机制。首先，作者将IEC细胞系HT-29暴露于缺氧状态，同时设置LPS暴露组和非暴露组。HIF-1α在缺氧后6h含量达到最高。
NF-κB 亚基p65/RelA磷酸化持续激活，且NF-κB上游抑制因子IκBα表达也被逆转，自噬也激活。同时，缺氧导致LPS诱导的NLRP3表达降低（Fig. 4a）和p62 mRNA表达升高。
同样的，缺氧导致NLRP3 mRNA在6和18h瞬时表达升高（Fig.4c）。NLRP3蛋白水平在蛋白酶体抑制剂MG132存在时表达量也下降，表明缺氧导致的NLRP3水平降低并非通过蛋白酶体机制（Fig.4e）。
有意思的是，在蛋白酶体抑制剂存在的情况下，缺氧可逆转泛素化蛋白积累，表明缺氧环境下，替代蛋白降解机制例如自噬被激活（Fig.4e）。
在获得了缺氧调节p62和NLRP3后，作者试图揭示p62和NLRP3的转录调节分子机制。通过p62启动子的序列分析获得了HIF-1α 和p65/RelA可能的结合位点（Fig.4f）。如图Fig.4g所示，p65/RelA的结合位点为NLRP3启动子的-468位点，HIF-1α的结合位点为NLRP3启动子的-150位点。
作者采用ChIP实验研究转录因子与p62和NLRP3启动因子的结合活性。ChIP实验结果显示缺氧处理6h后，HIF-1α与p62启动子的结合能力增强，说明HIF-1α在缺氧条件下可诱导p62表达（Fig.4f）。而NF-κB 与p62启动子结合能力基本不变（Fig.4g）。
相反的，由于在未缺氧处理细胞中NLRP3并没有持续性表达，因此，作者观察到NF-κB 与NLRP3启动子持续性结合。但是尽管在缺氧过程中HIF-1α含量增加，但是HIF-1α在NLRP3启动子上并没有富集。
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在IECs中，缺氧通过抑制NF-κB通路调节自噬
在HT-29细胞中，溶酶体的生物合成和积累可采用LysoTracker Yellow-HCK-123检测。缺氧可诱导溶酶体的积累，更进一步证明在低氧水平下自噬激活。Fig.5a检测线粒体活化水平。
为了探讨缺氧调节自噬和炎症保护之间的因果关系，在氯喹（自噬晚期抑制剂，阻止带有溶酶体的自噬体溶解）存在情况下，HT-29细胞暴露于缺氧环境。缺氧24h后，自噬激活 (Fig. 5b)，缺氧引起的p62降解关闭，p65/RelA磷酸化水平下降也非观察到（Fig. 5c）. 这些结果表明缺氧引发的自噬对下游促炎信号通路非常重要。相反的，缺氧仍然可以降低NLRP3蛋白表达 (Fig. 5c), 表明自噬并不调节NLRP3降解。
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缺氧降低NLRP3与mTOR的靶向结合
接下来，作者试图探讨NLRP3在自噬调节中的作用。作者在HT-29细胞中转染NLRP3-特异性siRNA，敲除NLRP3之后，mTOR磷酸化水平降低，基础自噬水平升高(Fig. 6a), 表明NLRP3通过促进mTOR 磷酸化持续性抑制细胞自噬。而且，Co-IP实验也证明NLRP3是mTOR直接作用靶点，而在缺氧环境下这一直接作用被抑制 (Fig. 6b)。
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DMOG 减轻DSS引发的结肠炎，降低NLRP3表达，促进自噬
为了研究HIF-1α稳定性对缺氧调节的抗炎效应的影响，WT小鼠暴露于2% DSS和羟化酶抑制剂DMOG。DMOG通过模拟缺氧环境抑制羟化酶活性激活HIF通路，可引起HIF-1α稳定和反式激活。DMOG和DSS同时处理的小鼠结肠炎病情得到明显缓解(Fig. 7a-7e)。
DMOG可降低DSS诱导的TNF-α，IL-6，IL-1β 和NLRP3 mRNA水平(Fig. 7g–j),并且增加自噬蛋白p62表达(Fig. 7l)，LC3表达也升高（Fig.7m）。在蛋白水平，DMOG处理的小鼠NF-κB 磷酸化和NLRP3水平降低，并且激活自噬 (Fig. 7n)。
参考文献：Hypoxia ameliorates intestinal inflammation through NLRP3/mTOR downregulation and autophagy activation
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