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“Artifificial in Vitro Synthetic Enzymatic Biosystem for the One-Pot Sustainable Biomanufacturing of Glucosamine from Starch and Inorganic Ammonia”，作者为中国科学院天津工业生物技术研究所孟东东等人。
氨基葡萄糖是一种天然存在的生物活性氨基单糖，广泛用于食品、化妆品和制药工业。它传统上是通过甲壳素的酸水解/酶解来生产的，但是存在可能的个体过敏风险、严重的环境污染和低产量。最近兴起的生产氨基葡萄糖的方法是使用工程微生物进行微生物发酵来生产N-乙酰氨基葡萄糖，然后将N-乙酰氨基葡萄糖酸水解成氨基葡萄糖。然而，这种方法不能一锅法生产氨基葡萄糖，并且受到酸水解过程引起的环境问题的影响。为了生产具有成本竞争力和环境可持续性的氨基葡萄糖，作者展示了一个人工体外合成酶生物系统，该系统由五种级联酶组成一锅，由麦芽糊精和无机氨生物生产氨基葡萄糖。作者对这种合成酶生物系统在pH值、酶组成、磷酸盐浓度和氨浓度方面进行了优化。优化后的酶混合物将10g/L麦芽糊精转化为7.9g/L氨基葡萄糖，转化效率为75.8% mol/mol葡萄糖当量的麦芽糊精。此外，对这种非发酵生物制造生物系统进行了简单的放大，以研究其工业潜力，从50g/L麦芽糊精中得到23.7g/L氨基葡萄糖。这种体外酶促平台为生产氨基葡萄糖提供了一种生物炼制技术，具有可预测的安全性、环境友好性和可持续性，从而代表了一种极具前景的工业规模生产氨基葡萄糖的替代方法。
GlcN(氨基葡萄糖，2-氨基-2-脱氧-D-葡萄糖)体外合成酶生物系统的设计
设计了一个体外合成酶生物系统，通过包括磷酸化、异构化、氨化和去磷酸化在内的级联生物催化将淀粉和无机氨转化为GlcN。该生物系统由五个连续的酶促反应组成:(1)在无机磷酸盐存在下，淀粉被αGP磷酸化，产生G1P；(2)通过PGM将G1P转化为G6P；(3)通过PGI将G6P异构化为F6P；(4)以游离氨为氨基供体，通过GlmD将F6P转化为GlcN6P；(5) GlcN6P被GlmP脱磷酸化为GlcN和磷酸盐。无机磷酸盐可以在一个罐中在反应1和5之间循环。虽然反应F6P转化为GlcN6P)可以通过使用昂贵的谷氨酰胺作为氨基供体的谷氨酰胺-果糖-6-磷酸转氨酶(GlmS)或使用无机氨作为氨基供体的GlmD来实现，但后者对于该研究来说是优选的，以促进工业放大并避免副产物的产生。热力学上不利的是，GlmP催化的最后一步的△G′值为17.2 kJ/mol，整个反应的△G′计算为22 kJ/mol，图B表明由淀粉和无机氨生产GlcN的产品收率高。
酶的选择和制备
在这种将淀粉和无机氨转化为GlcN的体外合成酶生物系统中，GlmP的底物特异性是高产率的关键决定因素。由于大多数磷酸酶具有高水平的底物环境，并且本研究中设计的反应体系包含多种糖磷酸中间体，包括G1P、G6P、F6P和GlcN6P，因此迫切需要一种对GlcN6P具有比G1P、G6P和F6P高得多的脱磷活性的GlmP。文献检索后，芽孢杆菌GlmP对GlcN6P(552M-1s-1)的催化效率(kcat/Km)分别比G6P(26.7M-1s-1)和F6P(8.3M-1s-1)高20.7倍和66.5倍，这是迄今报告的最高GlcN6P特异性脱磷活性。因此，在该研究中选择了芽孢杆菌GlmP，显示出3 U/mg抗GlcN6P、0.3 U/mg抗G6P、0.033 U/mg抗F6P的特异性活性，并且在37℃下对G1P的活性可以忽略不计。这些酶包括大肠杆菌αGP、热纤丝酵母PGM和热纤丝酵母PGI，在37℃时的比活性分别为5.6、20和396 U/mg。因为一些GlmD如大肠杆菌GlmD需要通过N-乙酰谷氨酰胺6-磷酸进行变构活化，所以选择了枯草杆芽孢菌蛋白酶的无活化剂GlmD，其在37℃下的比活性为4.5 U/mg。如图C所示，这五种酶在大肠杆菌中成功表达，并根据SDS-PAGE纯化至接近均一。
氨基葡萄糖生产的概念验证分析
配有安捷伦ZORBAX SB-C18色谱柱的高效液相色谱用于通过OPA柱前衍生化方法定量GlcN的浓度，标准气相色谱峰样品被洗脱为两个相邻的重叠峰，保留时间分别为9.7和10.1分钟。这两个峰的高度都与GlcN的浓度成正比，保留时间为9.7分钟的较高峰随后用于测定GlcN的浓度。在这个体外生物系统中，GlcN6P、(NH4)2SO4和衍生试剂OPA分别在7.1、15.4和21.05分钟出现响应峰。通过OPA衍生化方法未检测到麦芽糊精(淀粉衍生物)、葡萄糖和其他中间体(G1P、G6P和F6P)的响应信号。因此，OPA衍生化方法可用于GlcN的定量分析。淀粉被用作生产GlcN的底物。如前所述，为了获得高的产品收率，淀粉首先通过IA脱成麦芽糊精。因为αGP不能在淀粉的分支点之前由几个葡萄糖单元产生G1P，所以有必要使用IA来破坏支链淀粉的α-1，6-糖苷键并释放未分支的麦芽糊精。然后，反应混合物使用含有100 mM HEPES缓冲液(pH 7.0)、10 mM磷酸盐、10 g/L IA处理的麦芽糊精(测定为59.7 mM葡萄糖当量)、100 mM (NH4)2SO4、5mM硫酸镁和1 U/mL的五种级联酶中的每一种来进行在37℃下生产GlcN的概念验证实验。将不同时间点的反应溶液应用于HPLC以检测GlcN。如图B所示，9.6至10.2分钟的峰形与GlcN标准品的峰形相同，表明GlcN是由麦芽糊精和无机氨通过该生物系统成功合成的。随着反应的进行，生成的气相色谱峰的高度逐渐增加(图B)。根据峰高计算，在第10小时，GlcN的浓度逐渐增加到21.7mM(3.88g/L)，产率为36.3%，然后趋于平稳(图C)。2小时后，残余麦芽糊精迅速降至33.7 mM(葡萄糖当量)，并最终在20小时达到24.7 mM(葡萄糖当量)。从第10小时开始，葡萄糖一直保持在5.8mM(1.04g/L)的浓度。葡萄糖的存在是由于GlmP对G6P的无效活性。G6P浓度在第2小时达到最高值，并随着反应的进一步进行而降低。在整个反应过程中，G1P和F6P的浓度可以忽略不计(图C)。GlcN6P的浓度在第2小时达到最高值约1mM，然后逐渐降至可忽略不计的值。这验证实验表明，所设计的体外酶生物系统可以安全、可持续的从淀粉和无机氨一锅合成GlcN。
优化反应条件，提高产品收率
由于在实验中GlcN的低产物产率，该体外生物系统的反应条件随后被优化以获得更高的GlcN产率。基于图C的结果，当使用10 g/L麦芽糊精作为底物时，用于优化的反应时间设定为10小时。首先优化初始pH值。如图3A所示，当初始反应的酸碱度从7.0变为8.0时，副产物葡萄糖的浓度降低，而在酸碱度为7.5时，GlcN的浓度高于在酸碱度为7.0和8.0时的浓度。因此，生产GlcN的初始反应pH设定为7.5。
在最适pH值为7.5的条件下，对酶的剂量进行了优化。为了优化αGP的加载剂量(图3B)，当PGI、PGM、GlmD和GlmP分别以1 U/mL加载时，随着αGP的从0.25增加到2 U/mL，GlcN浓度迅速增加到25.8 mM的最高值。因此，最佳αGP的量为2 U/mL。当使用2 U/mL αGP、1U/mL PGI、1U/mL GlmD、1U/mL GlmP和0.25至4U/mL PGM时，在2U/mL PGM时获得最高浓度的GlcN(图C)。同样，PGI、GlmD和GlmP的最佳酶剂量值分别为3 U/mL、2 U/mL和2 U/mL(图DF)。结果表明，10 g/L麦芽糊精的最佳酶负载量分别为2、2、3、2和2 U/mL。
其次，在最佳pH值和酶浓度下，对磷酸盐和氨的浓度进行了优化。麦芽糊精需要磷酸盐磷酸化，但它可能在高浓度下沉淀Mg2 ，导致依赖Mg2 的酶失活和低产物产率。如图G所示，对于10g/L的麦芽糊精，磷酸盐的最佳浓度为20mM。在该GlcN合成生物系统中，氨作为GlmD催化反应的氨基供体。为了找出这种体外酶生物系统的最佳氨浓度，研究了在最佳pH、酶剂量和磷酸盐浓度下的GlcN生产，而(NH4)2SO4的浓度从25到250 mM变化。如图3H所示，GlcN的浓度在100 mM (NH4)2SO4时逐渐增加到37.8 mM，然后随着(NH4)2SO4浓度的进一步增加而趋于稳定。综上所述，10g/L IA处理的麦芽糊精合成GlcN的最佳条件为100 mM HEPES缓冲液(pH 7.5)、20 mM磷酸盐、100 mM (NH4)2SO4、2 U/mL αGP、2 U/mL PGM、3 U/mL PGI、2 U/mL GlmD和2 U/mL GlmP。
高浓度麦芽糊精生产氨基葡萄糖
为了测试这种体外生物系统的工业应用潜力，使用更高浓度的底物进行了5步生物转化。反应在37℃下在200mM的HEPES (pH 7.5)中进行，该HEPES含有50g/L的IA处理过的麦芽糊精(277.5mM葡萄糖当量)、500mM(NH4)2SO4、5mM硫酸镁、20mM磷酸盐和10 U/mL αGP、10 U/mL PGM、15 U/mL PGI、10 U/mL GlmD和10 U/mL GlmP的酶混合物。在30小时时，GlcN的浓度为132.3mM(23.7g/L)，摩尔收率为47.7%。此外，主要中间体G6P在整个反应期间保持相对高的浓度，在第2小时达到其最高浓度15.2 mM，并在第40小时逐渐降低至5.5 mM。由于GlmP对G6P的脱磷能力，32.5mM (5.8克/升)葡萄糖反应40小时后产生。在平行实验中，当在20小时向反应混合物中加入1 U/mL 4GT时，在30小时获得了141.8 mM (25.4 g/L)的增加的GlcN浓度，麦芽糖糊精的摩尔产率为51.1%。
总之，作者成功地构建了一个新的生物平台，用于通过体外酶促生物系统从淀粉和无机氨中生物制备GlcN。在优化反应条件后，五酶途径从10 g/L麦芽糊精得到75.8% mol/L的产物产率，从50 g/L麦芽糊精得到132 mM (23.7 g/L)的高产物浓度。未来的研究可能包括挖掘更多的GlcN6P特异性磷酸酶，阐明GlmP依赖于酸碱度的底物特异性的机制，创造耐热的体外生物系统，以及减缓GlcN的降解。尽管仍有进一步改进的空间，但这种体外酶生物系统已经显示出其作为更安全、更可持续和更绿色的工业化生产GlcN的替代方法的巨大潜力。
整理：高放
文章链接
https://dx.doi.org/10.1021/acscatal.0c0376
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