导 读
已有多款靶向药物获批治疗融合基因变异的非小细胞肺癌( NSCLC)，显示出了较高的反应率和持久应答，并改善了患者的生存预后和生活质量。但是，有些NSCLC患者虽然用DNA-NGS检测到了基因融合，却对相应TKI靶向治疗无反应，生存无改善（以ALK融合为例，用DNA-NGS检测到ALK融合的患者中，仍有约20%-40%对克唑替尼治疗无响应)。这种DNA-NGS检测阳性但靶向治疗疗效大相径庭的临床现象，亟待更好的手段来鉴别哪些患者将获益，哪些患者不会获益，以便更精准地指导治疗。
恒特基因长期专注融合基因的精准诊断。针对上述问题，恒特基因助力中国医学科学院肿瘤医院专家，对3,783例非小细胞肺癌开展了大型深入研究，连续在专业权威杂志Journal of Thoracic Oncology（IF: 13.3）上发表两篇文章，不但揭示了DNA-NGS的不足之处（假阴性：这部分患者错过了有效治疗的可能；假阳性：这部分患者接受了无效的治疗且可能延误病情），还从分子机理与功能层面进行了阐述，提出了未来的精准诊断策略。
基因融合/重排、易位是肿瘤驱动变异中一类非常重要的形式。实体瘤中发生基因融合变异的比例约为16.5%-20%，其中约36%可作为治疗靶点。针对ALK、ROS1、MET第14号外显子跳切、RET、FGFR2和NTRK1/2/3等融合靶点，FDA已经批准了多款相应的靶向药物。以非小细胞肺癌为例，FDA和或NMPA已经批准了克唑替尼、塞瑞替尼、阿来替尼、Brigatinib、Lorlatinib和恩沙替尼等药物治疗携带ALK融合的NSCLC患者，具有较高的反应率和持久应答，提高了患者的生存期并改善了生活质量。FDA也已批准了Larotrectinib和Entrectinib两款“广谱”靶向药物，治疗携带NTRK基因融合/重排的成人及儿童泛实体瘤患者，对NTRK基因融合阳性的治疗患者具有高反应率和持久应答，并可持续改善患者生活质量。
RNA-NGS检测能够有效避免融合/重排的漏检
国内外多个队列研究表明基于RNA为模板的NGS（RNA-NGS）检测融合/重排、易位要显著优于DNA为模板的NGS（DNA-NGS）[1,2]：基于DNA-NGS检测为阴性的NSCLC患者中，仍有5%-15%的患者携带可靶向治疗的融合/重排变异（图1），且DNA- NGS检测Panel越大，融合漏检率相对越高。例如：纽约纪念斯隆凯特琳癌症研究中心（MSKCC）的一项真实世界大队列研究中[1]，经MSK-IMPACT 468基因的DNA大Panel检测为驱动基因变异阴性的232例患者，经RNA-NGS又额外检测到了36例常见可治疗的融合/重排变异，经匹配的靶向治疗后，临床获益率达80%。表明这部分泛阴性的患者中基于DNA检测的漏检率达14.2%（图2）。这个RNA-NGS方法正是恒特基因科学家的早期发明。
图1. DNA-NGS检测为驱动泛阴性的NSCLC患者中，仍有相当比例携带可治疗的融合基因。
图2. MSK-IMPACT 468基因DNA大Panel检测为驱动基因变异泛阴性的NSCLC患者中，融合基因的漏检率达14.2%。
非小细胞肺癌NCCN指南正式推荐的8个治疗靶点中，有5个（63%）为融合/重排、跳读变异，NCCN指南也着重指出[3]：进行广泛的基因检测未发现有肿瘤驱动基因的患者（特别是从不吸烟的患者），应使用基于RNA为模板的NGS Panel进行检测，从而更大程度检出融合事件，避免漏检；DNA-NGS检测可能会漏检ROS1融合，NTRK1和NTRK3融合。更新的2021 V1版NCCN指南指出[3]：NGS检测是MET Exon 14跳读的最主要检测方法，基于RNA模板的NGS方法在MET Exon 14跳读的检测上表现出更多优势；在RET融合/重排的检测上，RNA-NGS检测要优于DNA-NGS检测。
DNA-NGS检测到的融合基因断点无法推测更具有功能意义的mRNA的融合模式
RNA-NGS检测除了能够有效避免融合变异的漏检外，是否还有其他的优势呢？回答这问题时，还得从DNA-NGS检测结果中经常见到的目标基因与基因间区域发生融合的现象谈起。DNA-NGS检测到的基因融合变异中，有一定比例为目标基因的部分序列与基因间区域（IGR，intergenic region，是位于基因与基因之间的一段非编码DNA序列，有时亦被称为垃圾DNA）发生拼接，即融合的拼接断点位于基因间的区域。融合伙伴为基因间区域的模式为融合变异中的一种重要类型[4]，且广泛分布在多种实体瘤中[5,6]。哈佛大学医学院近期发表的一项癌症中融合/重排变异的大规模研究显示[6]，通过 DNA-NGS检测到的13,698个融合变异事件中，“基因---基因间区域”融合模式的比例为28%；“基因---基因”融合模式的比例为38%；“基因间区域---基因间区域”融合模式的比例为34%（图3）。
图3. 癌症中大规模基因融合/重排分析显示，有28%的融合模式为“基因-基因间区域”融合。
在临床上，特别是2019年以来，有大量关于肺癌中“基因-基因间区域”的病例报道[7-14]，而且对相应靶向药物的治疗反应不一，如关于NSCLC中ALK融合模式的最新综述显示[15]，汇总的25例ALK与基因间区域发生的融合病例中，仅有3例报告了对克唑替尼的治疗具有响应（表1）。“基因-基因间区域”融合模式也越来越受到临床及病理专家的重视。
表1. 近期在NSCLC中报告了大量的 ALK与基因间区域发生融合病例。
最近有研究表明[16,17]，通过DNA-NGS检测到基因组上基因融合拼接断点信息无法有效预测转录组上的真实融合拼接模式，可能是由于染色体碎裂（Chromothripsis）或是RNA层面上对复杂融合的剪接（Complex Genomic Rearrangement Splicing）等因素造成的。那么，与基因间区域发生的融合是否能够在RNA层面上形成融合产物？最终产物的形式又是什么样的？在DNA水平上检测到的目标基因与基因间区域发生了融合的信息是否能够准确预测出真实的RNA产物呢？在临床上DNA水平检测到的非典型融合伙伴是否真实参与了融合变异的翻译和转录过程并最终能表达出有功能的融合蛋白？相关现象越来越受到临床专家和病理专家的关注。准确预测转录组上真实的融合变异模式，甄别出最终能够翻译出驱动肿瘤发生的融合蛋白的融合变异具有非常现实的临床意义，也亟待深入研究。
恒特基因助力中国医学科学院肿瘤医院病理科的专家针对上述问题进行了深入探索，连续在专业权威杂志Journal of Thoracic Oncology上发表两篇文章[18,19]（图4），从分子层面上对这一现象的机理进行了阐述，并提出了相应的检测策略。
图4. 恒特基因联合中国医科院肿瘤医院团队阐述NSCLC中基因融合的分子特征与临床意义。
在“Intergenic Breakpoints Identified by DNA Sequencing Confound Targetable Kinase Fusion Detection in NSCLC”这项研究中：DNA-NGS从NSCLC队列中检测到了26例目标基因的部分序列与基因间序列发生拼接的融合变异（“基因-基因间区域”融合模式）（表2），经恒特基因PANO-Seq进行RNA-NGS检测，发现有11例在转录本上表达了融合序列（其中4例为经典的EML4-ALK融合，2例为经典的TMP3-ROS1融合，4例为典型的RET融合），但DNA-NGS检测结果推断在RNA上的融合拼接断点位置与在RNA转录组上实测到的融合断点位置不一致，这一现象可能由多种原因导致：复杂重排（n=5）、选择性剪接（n=2）和相互型重排（n=4）；有5例在RNA转录本上完全没有表达融合序列；余下的10例由于缺乏足够的检测样本，无法进行RNA-NGS检测，有3例为ALK IHC检测阳性。3例ALK与基因间序列发生融合的病例（经或未经RNA的NGS/IHC证实），在接受克唑替尼治疗后达到部分反应（PR）；有1例ROS1与基因间序列发生融合的病例，虽然FISH结果呈阳性，经克唑替尼治疗一个月内即疾病进展，进行RNA-NGS没有检测到有功能的融合转录本，表明恒特基因RNA-NGS结果的准确性。
表2. NSCLC队列中DNA-NGS检测到的26例“基因-基因间区域”融合模式病例及恒特基因RNA-NGS检测的结果比较。
该研究结果：1. 进一步证明了DNA-NGS检测到基因组上基因融合拼接断点信息无法有效预测转录组上的真实融合拼接模式，在DNA层面上表现为复杂或罕见的融合，相当比例的在RNA 层面上实质为非常经典的融合；2. 并发现了DNA层面上检测到的目标基因与基因间区域（IGR，intergenic region）发生的融合，有相当比例在RNA层面上并不产生功能性融合转录本，最终并不能翻译出具有肿瘤驱动功能的融合蛋白；3. 提示使用DNA-NGS测序结果的基因间融合变异可能有相当一部分无法作为非小细胞肺癌治疗的靶点，即无法从相应靶向治疗中获益，对临床治疗决策可能会带来一定的混淆和误导，不能精准地指导临床治疗决策。并建议在临床实践中对于DNA-NGS检测到基因间融合的患者，应使用RNA-NGS/蛋白质分析进行额外的验证，以便能够更加精准的指导临床治疗。
该研究还存在一些局限和未能回答的问题，如：由于发现的“基因-基因间区域”融合模式的病例仅有26例，无法进行DNA-NGS检测结果、RNA-NGS检测结果与药物治疗疗效相关性的统计学分析，无法对DNA-NGS和RNA-NGS分别检测到的融合断点位置预测匹配的靶向治疗的效果进行比较；该研究中融合目标基因主要为ALK，DNA-NGS检测到的融合基因断点信息无法有效预测转录水平的真实融合模式的这种现象是否更为广泛地存在于肺癌的融合基因中仍需进一步证明。
为对上述发现提供更多的证据支持及对研究不足进行有效补充，恒特基因协助中国医学科学院肿瘤医院研究团队开展了更大规模的研究。
DNA-NGS检测到的部分融合变异事件预测非小细胞肺癌靶向治疗疗效不可靠
在“Potential unreliability of uncommon ALK/ROS1/RET genomic breakpoints in predicting the efficacy of targeted therapy in NSCLC”这项研究中纳入了3,787例NSCLC，传统ARMS-PCR方法在71.8%的肺腺癌病例中检测出驱动基因变异；ARMS-PCR 检测为阴性的330例病例进行DNA-NGS检测，57.6%的样本中检测出驱动基因变异；DNA-NGS检测为阴性的140例病例用恒特基因PANO-Seq进行RNA-NGS检测，10%的样本中检测到了基因融合/重排，MET exon 14 Skipping等驱动变异，进一步证明了DNA-NGS容易漏检部分融合变异（图5）。
图5. 该研究共纳入了3,787例NSCLC病例，队列1中(1,171例)经ARMS和DNA-NGS检测为驱动基因变异为泛阴性的病例中，恒特基因的RNA-NGS仍可检测10%的可治疗融合变异。
DNA-NGS结果与恒特基因的RNA-NGS结果比较
DNA-NGS检测到ALK融合241例、ROS1融合59例和RET融合76例。根据融合断点位置，融合伙伴类型及目标基因处于融合体中的方向（3’端还是5’端），将这些融合分为经典型融合（Canonical Fusion：单独的EML4-ALK、CD74/EZR/TPM3/SDC4-ROS1和KIF5B/CCDC6-RET融合）、非经典型融合（Non-Canonical Fusion：单独的非EML4-ALK融合、非CD74/EZR/TPM3/SDC4-ROS1融合和非KIF5B/CCDC6-RET融合）和 基型/相互型融合（Primary/Reciprocal Fusion：DNA-NGS检测到基型融合（非相互型）与相互型融合同时存在。这些非经典型融合和基型/相互型融合被定义为罕见融合。经典型融合280例（74.5%），非经典型融合45例（12.0%），基型/相互型融合51例（13.5%）。
对于经典型融合，DNA-NGS检测到的ALK和 RET融合亚型能与RNA-NGS结果一致；但64.3%（9/14）的ROS1 DNA-NGS结果与RNA-NGS结果存在差异（融合伙伴一致，但拼接的外显子发生偏移），可能与可变剪接相关。
对于非经典融合及基型/相互融合，DNA-NGS检测到的非经典融合及基型/相互型融合中有12.8%（6/47）在RNA-NGS/IHC检测结果为阴性，强烈支持DNA检测到的融合事件最终并没有产生融合转录本/融合蛋白，经恒特基因RNA-NGS检测为阴性（IHC证实也是阴性）的患者在接受匹配的靶向治疗后，疗效评估均为疾病进展（PD），PFS只有1-3个月（表3），说明了DNA-NGS结果的不可靠性。
表3. DNA-NGS检测为ALK/ROS1阳性，但恒特基因RNA-NGS检测为阴性的患者经克唑替尼治疗后，发生疾病进展，说明DNA-NGS结果为假阳性。
其余41例DNA-NGS检出的ALK/ROS1/RET融合中20例为非经典融合，21例为基型/相互型融合。经恒特基因RNA-NGS检测有70%（14/20）的非经典融合在转录组上实质为经典融合（在DNA上融合伙伴为罕见或未曾报道过的，而在RNA上均为常见的融合伙伴类型，如：EML4-ALK，CD74-ROS1，KIF5B-RET和CCDC6-RET），表明这部分患者是可以从匹配治疗中获益的。
为进一步验证相互型融合在RNA上是否真实存在，研究团队进行了全转录组测序（ WTS），结果与恒特基因的RNA-NGS检测完全一致，未检测到任何的相互型融合事件存在。但WTS花费高，且对RNA质量要求高，对这一批FFPE样本的检测成功率仅为37%，而恒特基因的RNA-NGS对同一批FFPE样本的检测成功率为94%。
依据恒特基因RNA-NGS检测结果的疗效比较：与经典型ALK融合患者相比，无论是非经典型融合还是基型/相互型融合患者经克唑替尼治疗后的mPFS均无明显差异（11.8个月 vs 11.0个月，P=0.763；11.8个月 vs 10.0个月，P=0.442）（图6A，6B）。但在DNA-NGS检测定义为罕见ALK融合（非经典型融合和基型/相互型融合）患者当中，RNA-NGS/IHC检测为ALK融合阳性的患者经克唑替尼治疗后的持续缓解时间显著长于RNA-NGS/IHC检测为ALK融合阴性的患者（11.0个月 vs 2.0个月，P=0.001）（图6C），说明RNA-NGS结果能更准确预测疗效。
图6. 依据恒特基因RNA-NGS检测结果，罕见型ALK融合患者组的mPFS与经典型融合患者组无明显差异，均可从克唑替尼的治疗中生存获益。
今年初，湖南省肿瘤医院的临床专家发表研究指出，与经典型ALK融合阳性患者相比较，非相互/相互型ALK融合阳性患者接受一线克唑替尼治疗疗效较差[20]。该研究中，DNA-NGS检测到150例ALK融合阳性患者，其中69.3%为单独EML4-ALK的经典型融合，18.7%为非相互/相互型ALK融合，剩余的12%为非EML4-ALK融合。我们期待RNA-NGS或IHC结果，以对这些临床现象从分子机理与功能层面进行更本质的深入探讨。
小 结
通过大样本队列系统性地梳理了ALK、ROS1和RET融合基因中的非经典型融合及基型/相互型融合是否都能产生相应的融合转录本，并探讨了非经典型融合及基型/相互型ALK融合与克唑替尼疗效之间的关系。证实了：1、通过DNA-NGS检测到ALK/ ROS1/ RET基因发生的非经典型融合及基型/相互型融合组断点预测的转录组上的融合模式有相当比例与真实的融合模式不一致；2、DNA-NGS检测到的部分罕见和非经典的ALK/ ROS1/ RET基因融合断点不是匹配靶向治疗疗效的可靠预测因子；3、恒特基因RNA-NGS方法相比DNA-NGS方法不但能减少假阴性，还能减少假阳性，具有更高的指导临床治疗的价值；4、恒特基因RNA-NGS对质量参次不齐的FFPE样本仍可达较高的成功率（94%；同一批样本经其它方法全转录组测序WTS成功率仅37%）。在临床实践中，对融合基因进行靶向治疗之前，应采取RNA-NGS或IHC确认，以更准确判断患者是否将获益。
指导临床精准诊疗的NGS检测实践新思考
精准治疗的关键在于基准检测出可治疗靶点的变异。DNA-NGS虽然可一次检测与癌症治疗相关的更多种的变异类型，但在鉴定和表征基因融合变异上确实存在一些局限（图7）[21]，不仅是技术上存在一定困难[1]，如：要覆盖非常冗长且还有大量重复序列的内含子区域才能准确地找到融合拼接的断点位置、高GC含量不利于探针有效覆盖、不同基因的内含子含有非常相似的重复序列不利于生信分析比对时的唯一匹配；而且复杂的转录或转录后的剪接加工过程，均可能会影响基因组融合/重排和易位的结果的真实性，即有些融合仅发生在转录组层面上。这些因素综合造成了容易漏检融合变异及检测到的融合信息与转录组上真实的融合情况不一致的问题，进而影响靶向治疗的评估和决策。RNA-NGS的检测融合/重排和易位的优势虽然显著得多[22]，但是大量研究也论述了，仅使用DNA模板或RNA模板尚不能完整发挥NGS的这一高通量测序技术的全方位优势。
图7. DNA作为模板检测基因融合/重排，易位以及跳读等结构变异主要存在4类局限。
为解决DNA-NGS融合检测存在一定局限性的问题，目前国外的临床实践策略主要有：“并行检测”和“序贯检测”这两种模式（图8）[1,23]。如：哈佛医学院麻省总医院（MGH）采用DNA-NGS和RNA-NGS同时进行的“并行检测”模式；纪念斯隆凯特琳癌症中心（MSKCC）则采用先行DNA-NGS检测，当检测结果为肿瘤驱动基因泛阴性或非经典型融合和基型/相互型融合时，再行RNA-NGS检测进行有益补充的“序贯检测”模式。但在实际操作层面上仍旧存在诸多困难：“ DNA-NGS”序贯“RNA-NGS” 的模式，不仅耗时，耽误及时治疗，还有可能由于前一次检测的样本消耗导致后一次检测的样本不足，而无法进行“RNA-NGS”；DNA-NGS和RNA-NGS“并行检测”模式，不仅增加了检测费用，同样也存在耗费样本量较大的问题。故仍旧需要一种更加理想的临床实践解决方案。
图8. 国外知名医疗机构针对融合/重排、易位和跳读等结构变异检测容易“漏检”和“错检”而提出的解决方案。
DNA合并RNA检测更精准，更全面，必将成为临床检测的趋势
恒特基因成立伊始，就一直致力于开发更优的基于RNA靶向测序检测融合变异的技术和产品。恒特以RNA为模板，开发了深度改良的单端锚定多重PCR建库方法---PANO-Seq®技术进行融合检测，结合针对性的生信流程分析异常拼接的外显子，能实现融合基因检测的高准确度，有效避免漏检和错检。为了简化检测流程并且提高检测结果的全面性和准确性，恒特基因发明了一种在单个反应体系中同时将DNA和RNA模板构建成NGS文库的“一管双检” 、“单端开放”的全方位方法（图9），可同时检测所有变异类型，在以DNA为模板检测单核苷酸变异（SNV）、插入缺失（Indels）、拷贝数变异（CNV）和融合（Fusion）等基础之上，充分的发挥了RNA模板检测基因结构变异（融合，重排，易位，RNA剪接异常）和表达的优势。PANO-Seq®技术开发的基因检测产品必将让更多的肿瘤患者获益。
图9. 恒特基因DNA RNA“一管双检”、“单端开放”的PANO-Seq ®技术特点与目前国内外其他DNA RNA“双管双检”模式特点的比较。
关于恒特基因：
肿瘤防治，精准测序。恒特基因专注于肿瘤医疗领域的高通量测序检测，利用独有的平行扩增数字优化测序（PANO-Seq®全景测序）高精度建库方案，提供可靠有效的产品应用。恒特业务重点为对肿瘤病因及治疗具有重要意义而又难以检测的基因突变类型-基因融合，并同步检测其它多种类型突变。
恒特基因目前正加大与全国多家医院合作，开展PANO-Seq的临床转化研究工作，包括多种实体瘤、软组织肉瘤及血液系统肿瘤的精准诊断，并与产业链上下游企业如国内CTC行业领头企业深圳晶准医学公司合作以拓展综合运用场景，与加样仪器制造商合作以加速自动化操作、缩短报告流程，并积极寻找与不同测序硬件平台的合作。
详情请访问 www.helitecbio.com。
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