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*本文首发于“纳米酶Nanozymes”公众号，2023年1月11日
*编辑：杜江
以下文章来源于纳米岛 ，作者Nanoeast
转载责编：杜江
首次发布：
普鲁士蓝纳米酶标准物质研制全过程
◆ 研究背景：
中国科学家作为纳米酶的发现者、原创概念的提出者，系统地研究了无机纳米材料的酶学特性、酶促反应动力学特征以及类酶催化机制，建立了纳米酶标准术语、催化活性测量标准方法，并将其作为天然酶的替代品应用于疾病诊断、环境监测等领域。随着纳米酶领域的飞速发展和不断壮大，纳米酶产品已经走向市场，这对检测、计量、认证和标准提出了越来越迫切的需求。目前国际上有关纳米酶的相关标准十分缺乏。中国作为国际上纳米酶领域的领跑者，前瞻性地开展相关标准研究，领先占领部分技术领域及市场，对于我国在纳米酶领域继续保持优势地位具有关键作用。
◆ 提出问题：
当前，如何准确评估纳米酶的类酶活性是研究人员关注的一个重点问题。由于纳米酶的催化活性与颗粒尺寸、形貌、组成、表面修饰、晶体结构等因素息息相关，这使得对其催化活性的准确测量和评价变得十分困难。此外，即使是相同的纳米酶材料，不同的实验室和/或分析方法（如比色法、酶促反应动力学评价、比活力计算）往往产生不同的测量结果和表达形式，从而导致实验室测量结果不具可比性，形成“数据孤岛”（图1）。例如，通过与天然辣根过氧化物酶（HRP）的米氏动力学常数（如Km、Vmax和Kcat）做比较来评价纳米酶的类过氧化物酶（POD）活性时，不同实验室出具的参照物HRP的测量结果总是有差异的，这可能与HRP来源、生产批次、活性状态以及各实验室测量条件和环境的不同有关。因此，在评价纳米酶类酶活性时很难获得令人信服的、具有可比性的测量结果，这极大地阻碍了纳米酶的基础研究和实际应用。
图1：纳米酶类酶活性测量—“数据孤岛”。
◆ 解决方案：
为解决上述问题，东南大学张宇教授联合顾宁院士、阎锡蕴院士及许海燕教授团队建立了首个氧化铁纳米酶类POD活性测量国家标准方法（GB/T 37966-2019），参与单位包括中国科学院生物物理研究所、中国医学科学院基础医学研究所、南京东纳生物科技有限公司、基蛋生物科技股份有限公司、江苏省计量科学研究院、南京医科大学第二附属医院检验中心。在此基础上，需要注意的是，由于各实验室的检测能力、仪器状态、检测人员各有差异，仅仅通过遵循标准方法并不能保证测量结果的真实性和可比性。有证标准物质的使用是评估测量结果及实验室分析能力的另一个基本手段（图2）。然而，目前为止，国际上尚未出现有关纳米酶标准物质的相关报道。因此，纳米酶类酶活性标准物质的研制对我国能尽快研发出催化性能优异、具有自主知识产权的纳米酶产品具有重要意义，有利于我国抢占纳米酶市场先机。
图2：标准方法和标准物质是保证测量结果准确性的两大法宝。
为此，该团队进一步选择稳定性高、可量产、具有类多酶活性且在生物医学领域已有应用的普鲁士蓝纳米颗粒（PBNPs）作为标准物质侯选材料，选择目前纳米酶领域应用最多的类POD活性作为特性量值，依据ISO 35和ISO 17034指南的要求研制了国际上首个纳米酶类酶活性标准物质。具体包括以下五个过程：PBNPs的稳定制备、均匀性检验、稳定性监测、多家实验室联合定值和不确定评定（图3）。首先，通过稳定的制备工艺合成尺寸均一的64 nm PBNPs，并将其定浓分装为1 μg Fe/mL、5 mL/瓶的标准物质侯选物。接着，均匀性和稳定性研究表明不同分装单元的PBNPs的类POD活性是一致的，且在4°C避光储存条件下类酶活性可稳定一年保持不变。通过八家实验室联合定值及不确定度评定，最终确定该PBNPs标准物质的特性量值确定为174 ± 13 U·mg-1 (k = 2)。此外，研究者还将该PBNPs 标准物质应用于葡萄糖的试纸条及湿化学法检测，并通过与其他两种不同的PBNPs做比较，举例说明了纳米酶类酶活性的准确定值在分析检测领域中的重要性。
图3：普鲁士蓝纳米酶类过氧化物酶活性标准物质研制。
作为类POD酶活性的质量控制工具，PBNPs标准物质的应用可以有效确保各实验室测量结果的准确性和可比对性。该工作填补了纳米酶领域标准物质的空白，有望取代天然HRP，成为评估分析方法和实验室测量能力的有效基准，助力纳米酶的科学研究及产业化发展。同时，该工作也为研制其他种类纳米酶标准物质提供了有效参考。相关研究成果以“Reference material of Prussian blue nanozymes for their peroxidase-like activity”为题于2022年10月19日在线发表在《Analyst》上。该论文第一单位为东南大学，马明副教授、顾宁教授和张宇教授为该论文的通讯作者；博士研究生董海姣为该论文的第一作者。
参考文献：
https://doi.org/10.1039/D2AN01401G
Haijiao Dong, Guancheng Wang, Kaizheng Feng, Xiaohan Wu, Yaoyao Fan, Wei Zhang, Ming Ma*, Ning Gu* and Yu Zhang*, Reference Material of Prussian Blue Nanozymes for the Peroxidase-like Activity, Analyst, 2022, 147, 5633-5642.
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