江陵天星观一号楚墓出土饱水木漆器F455中细菌对硬松木的腐蚀研究，我来为大家讲解一下关于简要分析考古学渐热的原因?跟着小编一起来看一看吧!
简要分析考古学渐热的原因
江陵天星观一号楚墓出土饱水木漆器F455中细菌对硬松木的腐蚀研究
章 俊1，雷 琼2，邱祖明2，范晓丹1，汪 俭1，詹亚斌1，马立安1
(1. 长江大学生命科学学院，湖北荆州 434025；2． 湖北省荆州文物保护中心，湖北荆州 434020)
摘要：研究木质文物中的细菌对木材腐蚀性影响，筛选防腐剂抑制腐蚀性强细菌的腐蚀作用，是延长木质文物保存期的一种有效的生物保护措施。为研究饱水木漆器F455及其水环境中细菌的种类，以及对木材的腐蚀程度，采用16S rRNA基因序列分析方法及生理生化试验，对饱水木漆器F455及水环境中细菌进行鉴定，并选取典型菌按5×108个/瓶菌量接种马尾松心材(悬于无菌自来水中)，37℃培养120d，测试木材的损失率。结果发现，从F455文物挑选的32株细菌中，有29株菌鉴定为芽孢杆菌属(Bacillus)，为优势菌属，其余为短杆菌属(Brevibacterium)、短波单胞菌属(Brevundimonas)和产碱杆菌属(Alcaligenes)各1株。水样样品中细菌菌属较F455文物样品中丰富，27株菌有9个属，其中短杆菌属(Brevibacterium)有9株，为优势菌属，其余交替赤细菌属(Altererythrobacter)有5株，短波单胞菌属(Brevundimonas)有4株，产碱杆菌属(Alcaligenes)有3株，黄杆菌属(Flavobacterium)有2株，芽孢杆菌属(Bacillus sp.)、白色杆菌属(Leucobacter)、类芽孢杆菌属(Paenibacillus)、苍白杆菌属(Ochrobactrum)各1株。从2种样品材料的分离菌中共挑选出14株典型菌进行木块腐蚀试验，与对照组比较，其中有9株菌差异极显著。说明这些菌对马尾松木材有一定的腐蚀作用，但是腐蚀率非常低，最高仅1.56%。表明这些细菌对试验木材马尾松腐蚀并不严重。该研究分析了饱水木漆器长期保存在水槽中细菌对木漆器的影响，丰富了饱水木漆器文物生物影响的理论依据。
关键词：饱水木漆器；16S rRNA基因；木材腐蚀率；文物保护
0 引 言
中国木漆器的历史渊源最早可以追溯到7000多年前，春秋战国以后，漆文化更是发展迅速[1]。汉代以后漆器使用已十分广泛，几乎遍及人类日常生活的各个方面，木漆器上的图形文字以及色彩的运用等都包含重要的考古信息。木漆器出土以后，为防止其自然干燥引起收缩、龟裂和变形，一般将这些木漆器浸泡在水中保存。木质文物易受到微生物的侵蚀，特别是真菌的侵蚀，一旦环境适宜，真菌孢子就会在木质文物表面快速繁殖，给文物造成巨大的破坏[2]。事实上，不仅仅是真菌，细菌也会对木材造成一定腐蚀，木材主要成分为纤维素、半纤维素和木质素，而自然界中存在许多降解纤维素、半纤维素和木质素的细菌[3-5]。目前已经发现大量与木质文物腐蚀相关的细菌[6]。因此，研究木质文物中的细菌对木材腐蚀性影响，筛选防腐剂抑制腐蚀性强细菌的腐蚀作用，是延长木质文物保存期的一种有效的生物保护措施。课题组已对江陵天星观一号楚墓出土的饱水彩绘木漆器及保存水中的细菌进行调查，研究发现文物木漆器F455中细菌数量590CFU/g，其水样中细菌数量为1590CFU/L[7]，但未做种属鉴定及木材腐蚀性研究。本研究针对上述问题，鉴定细菌种属，模拟文物保存的水环境，评价其对木材腐蚀性影响，针对腐蚀性强的细菌，拟筛选杀菌抑菌剂，以期为延长饱水木漆器的保存期提供生物学保护依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 试验菌株 试验菌株为木漆器F455文物及保存环境水样(荆州市博物馆)中分离的细菌[7]；F455文物于1978年江陵天星观一号楚墓(战国)出土，经清洗干净，外表无杂物及污物，保存在荆州博物馆水池中36年；从F455文物分离的细菌中挑选32株，从保存环境的水样中分离的细菌中挑选27株，均来源于本实验室。
1.1.2 马尾松 马尾松2根(胸高部位、胸径280mm、长2m)，购自荆州市某木材市场。
1.2 方法
1.2.1 16S rRNA基因分子鉴定 利用煮沸法[8]获得细菌DNA模板，利用细菌通用引物27F(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)和1492R(5’-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3’)扩增细菌16S rRNA基因序列，PCR反应体系(50μL)为：10×Taq Buffer 5μL，dNTPs(2mM)6μL，Taq(2U/μL) 1μL，27F(10μM)1μL，1492R(10μM)1μL，ddH2O 32μL，4μL DNA模板。PCR扩增程序为：94℃预变性4min；94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸90s，30个循环；72℃终延伸10min。反应结束后，取3μL PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，PCR合格的样品送至上海生工武汉测序部进行测序，序列在Eztaxon上比对分析，并采用MEGA软件进行细菌分类分析。
1.2.2 生理生化鉴定 生理生化鉴定项目包括：革兰氏染色、明胶液化、柠檬酸盐利用、过氧化氢酶、氧化酶、糖(醇)(果糖、阿拉伯糖、蔗糖、木糖、葡萄糖、甘露醇)发酵、吲哚、尿酶、H2S产生、VP、甲基红、硝酸盐还原及淀粉水解等试验。具体生化试验方法参照文献[9，10]。
1.2.3 测试菌体对木材的腐蚀作用 按文献[11]选取马尾松心材(边部内侧与髓心之间颜色较深部分)切割成2cm×2cm×1cm小块状，装入烧杯中放入(103±2)℃烘箱中烘至恒重[12]，每次称量前将木块放入干燥器中冷却。恒重后称量10g左右的木块分装在规格相同的蓝盖螺纹广口圆瓶中，121℃ 30min灭菌后冷却备用[11，13]。采用液体培养基摇菌收集菌体，用无菌生理盐水洗涤并重悬菌体，采用稀释涂布平板计数法计数，每瓶中接菌数目为5×108个[14]，每个菌株6个重复，并用不接菌作为对照，用无菌自来水定容至250mL，37℃培养120d后测木块恒重，计算木块质量损失率[11]，并采用Origin7.5软件进行显著性分析。
2 结果与分析
2.1 16S rRNA基因分子鉴定结果
16S rRNA基因扩增，序列长度为1500bp左右，序列比对发现，F455文物样品中，芽孢杆菌属(Bacillus sp.)为其优势菌属，占90.63%，保存环境水样中短杆菌属(Brevibacterium sp.)为其优势菌属，占33.3%。F455文物样品中检测到的细菌菌属仅有4种，分别为Bacillus、Brevundimonas、Brevibacterium和Alcaligenes。环境水样样品中检测到的细菌菌属有9种，分别为Brevibacterium、Altererythrobacter、Flavobacterium、Paenibacillus、Brevundimonas、Ochrobactrum、Alcaligenes、Bacillus、Leucobacter，详见表1和表2。木漆器及水样中典型微生物序列，以及在Eztaxon数据库中相似度最高的序列一起，以邻接法构建系统发育树，如图1。S1、S7、F1、F2、F3和F4为厚壁菌门(Firmicutes)，S2、S4和F6为放线菌门(Actinobacteria)，S3、S5、S8、S9、S10、F7和F8为变形菌门(Proteobacteria)，S6为拟杆菌门(Bacteroidetes)。S1同Bacillus toyonensis及Bacillus thioparans同源性近，与序列比对结果不一致，其他样品同源性与序列分析结果一致。
表1 F455文物样品中细菌16S rRNA基因序列相似性分析
Table 1 The 16S rRNA gene sequence similarity analysis of bacteria of F455 wood samples
表2 F455水样样品中细菌16S rRNA基因序列相似性分析
Table 2 The 16S rRNA gene sequence similarity analysis of bacteria of F455 water samples
图1 F455文物样品和环境水样中细菌16S rRNA基因序列邻接法分析细菌类群结构
Fig.1 Neighbor-joining of bacterial community structure based on 16S rRNA gene sequences of the bacteria
from F455 wood sample and water sample
2.2 生理生化结果
根据16S rRNA基因序列分析，在F455木漆器样品鉴定菌株中挑选出8个典型菌株，标号为F1- F8，在水样中挑选出10个典型菌株，标号为S1- S10，进行生理生化试验，结果详见表3和表4。参考文献[10]，S1、F1、F2、F3、F4、F5为革兰氏阳性菌、过氧化氢酶为阳性，产芽孢，与芽孢杆菌属相符；S2为革兰氏、甲基红阳性菌，H2S产生、硝酸盐还原、淀粉水解及VP实验为阴性，与白色杆菌属相符；S3为革兰氏阴性杆菌，硝酸盐还原阴性，与交替赤杆菌属相符；S4和F6为革兰氏阳性短杆菌状菌，过氧化氢酶阳性，与表皮短杆菌属相符；S5和F8为革兰氏阴性菌，氧化酶和过氧化氢酶阳性，硝酸盐还原阴性或阳性，吲哚产生为阴性，与粪产碱杆菌属相符；S6为革兰氏阴性菌，过氧化氢酶阳性，VP和甲基红反应均为阴性，生化反应不活泼，与黄杆菌属相符；S7为革兰氏阳性杆状菌，过氧化氢酶阳性，与类芽孢杆菌属相符；S8、S9和F7革兰氏阳性，分散的短杆菌，水解明胶，过氧化氢酶阳性，与短波单胞菌属相符；S10为革兰氏阴性菌，过氧化氢酶阳性，吲哚产生为阴性，与苍白杆菌属相符，但S10水解明胶与苍白杆菌属不相符。结合16S rRNA基因序列分析，初步确定S1和F4为芽胞杆菌(Bacillus sp)、F5为东洋芽孢杆菌(Bacillus toyonensis)、F3为盐敏芽孢杆菌(Bacillus halmapalus)、F2为病研所芽孢杆菌(Bacillus idriensis)、F1为北纳创联产硫芽孢杆菌(Bacillus thioparans)、S7为树形类芽孢杆菌(Paenibacillus dendritiformis)、S2为干丘亮杆菌(Leucobacter aridicollis)、S4和F6为表皮短杆菌(Brevibacterium epidermidis)、S5和F8为粪产碱杆菌(Alcaligenes faecalis subsp. Phenolicus)、S3为交替赤杆菌(Altererythrobacter sp.)、S10为苍白杆菌属(Ochrobactrum sp.)、S9为短波单胞菌(Brevundimonas olei)、S8和F7为缺陷短波单胞菌(Brevundimonas diminuta)、S6为水氏黄杆菌(Flavobacterium mizutaii)。
表3 F455文物样品中细菌生理生化试验结果
Table 3 The physiological and biochemical results of bacteria of F455 wood samples
注： 阳性；-阴性；N未试验。
表4 F455环境水样中细菌生理生化试验结果
Table 4 The physiological and biochemical results of bacteria of F455 water samples
(续表4)
注： 阳性；-阴性；N未试验。
2.3 细菌对木材的腐蚀
从F455样品鉴定菌中选择6株、环境水样鉴定菌中选择8株，共14株细菌对马尾松心材进行腐蚀试验，结果见表5。同对照组相比较，F1(Bacillus thioparans)、F3(Bacillus halmapalus)、F4(Bacillus cereus)、F5(Bacillus toyonensis)、F7(Brevundimonas diminuta)、S2(Leucobacter aridicollis)、S4(Brevibacterium epidermidis)、S5(Alcaligenes faecalis subsp. Phenolicus)、S9(Brevundimonas olei)均存在极显著差异，但试验木块的质量损失率仅为1.56%，属于微弱腐蚀；只有F2(Bacillus idriensis)、S7(Paenibacillus dendritiformis)、S10(Ochrobactrum pseudogrignonense)差异不显著；S3(Altererythrobacter atlanticus)和S6(Flavobacterium mizutaii)同对照组相比差异极显著，但是对木材的腐蚀率比对照组小。
表5 回接细菌对木块的平均损失率
Table 5 The average loss rate to wood for bacteria
注：**为极显著，未标注为没有显著差异，CK为未接菌的阴性对照
3 讨 论
对F455及保水环境中分离纯化的细菌进行16S rRNA基因分子鉴定发现，水样中细菌种属比F455木漆器样中多，并且基本包含了木漆器样品细菌，水样中细菌来源可能部分来自外界环境，部分来自木漆器样品；由于分离细菌时没有对F455样品表面进行消毒杀菌处理，只是用无菌水清洗F455表面3次，故木漆器F455样品中的细菌主要来自F455内部，也有可能来自F455表面。徐润林[6]研究表明，欧洲木质文物中常见的好氧菌有噬胞菌(Cytophaga)和纤维弧菌(Cellvibrio)；厌氧菌有梭状芽孢杆菌(Clostridium)、芽孢杆菌(Bacillus)、假单胞菌(Pseudomonas)、黄杆菌(Arthrobacter)、黄草杆菌(Flavobacterium)和螺旋菌(Spirillum)。本研究从F455木漆器样品中分离到Bacillus、Brevibacterium、Brevundimonas、Alcaligenes等细菌，从环境水样中分离到Brevibacterium、Altererythrobacter、Flavobacterium、Paenibacillus、Brevundimonas、Ochrobactrum、Alcaligenes、Bacillus、Leucobacter等细菌，这与欧洲文物木漆器中细菌种类存在一定差异。F455木漆器样品中细菌优势菌属为芽孢杆菌属(Bacillus)，这可能是因为芽孢杆菌能够产芽孢，对逆境环境耐受能力强，生存时间久。汤显春等[15]对曾侯乙墓穴木椁中微生物进行分离，其优势菌属也是芽孢杆菌属。Landy[16]等分析了来自不同地区、不同年代的108份饱水木质文物样品细菌群落结构，同样分离到Bacillus、Brevundimonas，但是从文物木漆器中分离到Brevibacterium和Alcaligenes细菌尚未见报道。
本研究选用马尾松作为腐蚀试验材料，是因马尾松的耐腐蚀性较差，腐蚀效果较容易出现，是木材天然耐腐性室内试验的较理想材料[11，17]。汤显春等[14]研究曾侯乙墓穴木椁中的微生物对木材的降解也选用马尾松作为试验材料。
本研究测试从F455木漆器样品及其水样样品中分离的14株细菌对马尾松心材的腐蚀率，相较于对照组，除少量几个样品外，都差异极显著。说明这些细菌对硬松木具有一定腐蚀作用，但腐蚀率最高仅1.56%，质量损失低于10%，只有微弱腐蚀性，故没有进一步检测木材的其它指标。细菌对马尾松腐蚀率过低，其可能的原因是营养的缺乏，仅硬松木中的碳源氮源等营养元素不足以维持细菌的良好生长。荆州博物馆中保存文物木漆器的水同样营养缺乏，以及水中缺乏充足的氧气，少量存在的细菌对木漆器的腐蚀作用比较微弱。当然，本研究以单一的细菌研究其对马尾松的腐蚀，存在一定的局限性。微生物对木材的腐蚀作用可能是多种细菌或者细菌与真菌共同作用的结果。闫晨曦和黄伟[18]研究表明，降解木材的细菌主要属于杆菌属(Bacillus)、产气杆菌属(Aerobacter)和假单孢菌属(Pseudomonas)，这与本研究部分相似。研究表明，某些细菌能够以异养方式产生胞外细菌纤维(Bacterial cellulose，BC)[19]。例如，醋酸杆菌属(Acetobacter)细菌可快速繁殖分泌细菌纤维素用来填充古代木质内部细胞壁的坍塌结构，造成木质文物湿重变化不大[20，21]。细菌纤维素的发酵生产一般是在含葡萄糖的复杂营养介质中进行的[22]。试验中S3(Altererythrobacter atlanticus)和S6(Flavobacterium mizutaii)菌株造成试验木块质量损失率明显低于对照组，是否也是因能合成细菌纤维素引起，有待做进一步试验。
4 结 论
1) F455文物木漆器样品中，芽孢杆菌属(Bacillus sp.)为其优势菌属，水样中短杆菌属(Brevibacterium sp.)为其优势菌属。
2) F455文物木漆器保存在水槽中，单一细菌对木漆器的腐蚀作用有限。但是，有关微生物对出土木漆器的危害有必要进一步研究，尤其是真菌及其与细菌协同作用的影响。
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原载于 《文物保护与考古科学》 2017年第4期
版权归原所有者，本文仅供交流
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