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王潇1,涂世杰1,刘鑫1,赵悦晗1,匡翠方1,2,3,刘旭1,3,郝翔1
1 浙江大学光电科学与工程学院现代光学仪器国家重点实验室,
2 浙江大学宁波技术研究所
3 之江实验室
超分辨显微成像技术是细胞生物学中研究细胞器结构、相互作用和蛋白质功能的强大工具，具有突破光学衍射极限的分辨能力，从纳米尺度上为细胞生物学提供了新的分析手段，对生命科学相关领域具有重大意义。
然而，受衍射极限的影响，超分辨显微镜的轴向分辨率相比于横向分辨率要更难以提高，这导致实现细胞结构亚百纳米分辨率的三维成像更为困难。于是，科学家们基于物理和化学方法提出了许多突破光学衍射极限的显微成像技术。
目前，超分辨显微成像主要分为三种技术。第一种技术以受激辐射损耗（STED）显微术为代表。第二种技术以单分子定位显微术（SMLM）为主，其代表性技术有光激活定位显微镜（PALM）和随机光学重构显微镜（STORM）。第三种技术是结构光照明显微术（SIM）。理论上，SIM的分辨率极限为传统光学显微术的两倍，而STED技术和SMLM的分辨率没有限制，因此下面将围绕STED技术和SMLM两种技术，介绍多种三维成像技术分辨率的提升。
受激辐射损耗显微镜的三维成像技术
在受激辐射损耗（STED）显微成像中，轴向分辨率仍然难以提升，以及像差的存在，成像的深度也受限。因此，在三维成像中，提高轴向分辨率、增大成像深度、实现具有各向同性三维分辨率的深度成像至关重要。
1、提升三维分辨率
要想提升STED显微成像系统的三维空间分辨率，实现样品的三维超分辨成像，关键是要让损耗光在样品焦平面处聚焦成一个三维中空暗斑，只有暗斑中心所在位置可以发出荧光，其他位置的荧光都被损耗了。要想实现这一点，目前的技术主要有基于单物镜架构的3D-STED和基于双物镜架构的isoSTED，前者相对于后者，架构更为简单且容易实现，但三维分辨率略低于后者。
基于单物镜架构的3D-STED的技术关键是对损耗光加载0/π环形相位(也叫作“Top-hat”相位），可以使用相位板和空间光调制器(SLM)对损耗光进行波前调制。该架构更为简单且容易实现，相比于共聚焦显微成像技术，可获得90~110 nm的近乎各向同性的三维分辨率。为了进一步提高横向分辨率，还可以再引入一路损耗光加载传统的0~2π涡旋相位，增强横向上的损耗，其原理图如图1所示。
图1 基于单物镜架构的3D-STED纳米显微技术原理图。(a)光学装置简化示意图；(b)PSF结果
基于双物镜架构的isoSTED的技术关键是损耗光通过两个对置物镜在样品面发生干涉而形成暗斑。2002年，研究人员首次将STED与4Pi技术相结合，获得了33 nm的轴向分辨率。2008年，研究人员提出的isoSTED技术可以在此架构下提升横向分辨率,得到40~45 nm的各向同性分辨率，光学原理图如图2所示。2020年，浙江大学光电科学与工程学院现代光学仪器国家重点实验室的郝翔等人将自适应光学技术（AO）用于isoSTED系统(AO isoSTED)，以三维亚50 nm的分辨率对全细胞和组织样品进行成像。
图2 基于双物镜架构的isoSTED纳米显微技术原理图。(a)光学装置简化示意图；(b)PSF结果
以上这些技术都是旨在通过缩小荧光发光区域即减小荧光点扩散函数（PSF）体积来提升成像时的三维分辨率。
此外，还可以通过化学手段对样品进行各向同性的物理膨胀，即膨胀显微技术(ExM)进行成像，这样三维分辨率得到提升，且提升的倍数与膨胀的倍数相当。进一步地，ExSTED技术结合了样品膨胀显微技术和STED超分辨显微技术，可以得到亚10 nm的二维分辨率和亚50 nm的三维分辨率。
2、增大三维成像深度
在三维成像应用中，保持在不同深度处有较高的三维分辨率是很有必要的。成像深度往往受限于成像过程中的光散射和像差。为了减小成像过程中的光散射和像差，增大三维成像深度，既可以通过匹配物镜与浸没液折射率来实现，如选择合适的物镜和使用样品清洁技术，又可以通过像差校正的光学技术来实现，如AO STED技术。
针对不同的组织样品，选择合适的物镜浸没液至关重要。比如，在对富含脂质的脑组织切片进行成像时，选择甘油物镜更合适。额外的校正环可以进一步补偿折射率不匹配问题。在对活细胞和膨胀样品成像时，选择水镜更为合适。额外的自适应光学元件，如空间光调制器可以对损耗光的暗斑进行球差校正。
使用自适应光学技术可以进一步校正由样品折射率变化导致的像差。自适应光学技术通过动态校正元件(如空间光调制器和变形镜)，采用特定的像差测量技术和控制方法(如直接波前测量和间接像差优化)来补偿畸变的波前，提高成像质量。将自适应光学技术用于STED显微术时，空间光调制相比于变形镜对光的偏振和波长敏感，因此常将其放置于损耗路，用来调制损耗光，而变形镜常被放置于激发光、损耗光和荧光共同所在的光路，用来调制所有光束。值得注意的是，为了保证调制效果，空间光调制器和变形镜需要和物镜后焦面呈光学共轭。
2020年，浙江大学郝翔等人搭建了一套AO isoSTED成像系统，利用间接像差优化的自适应光学技术，以三维亚50 nm的分辨率实现了对全细胞和组织样品的成像，成像深度可达30 μm。此外，将中空贝塞尔光束作为损耗光，高斯光束作为激发光的GB-STED技术，也可在类似脑组织灰质的样品中实现深度成像。
单分子定位显微镜的三维成像技术
在单分子定位显微成像中，荧光分子的横向位置可以根据其图像中类高斯分布的质心确定。可是对于轴向定位，虽然可以通过离焦的光斑大小进行轴向定位，但是无像差的点扩散函数（PSF）关于焦平面对称，这使得PSF在焦平面两侧距离相同的位置处是相同的，无法确定离焦方向。除此之外，PSF的轴向位置变化灵敏度较低、离焦信号信噪比较低、定位深度依赖于系统景深等问题也亟须解决，图3为无像差的PSF在不同轴向位置的图像。于是，人们提出了多种三维成像技术来提高SMLM的轴向分辨能力、增大成像深度,例如PSF工程、多位置观测、超临界角荧光和4Pi显微镜等其他方法。
图3 无像差的PSF在不同轴向位置的图像
1、PSF工程
由于无像差的PSF在焦平面两侧是具有对称性的，那么可以人为改变PSF的空间分布，将PSF的轴向位置信息编码到PSF的横向形状上，并通过横向形状进行轴向定位。这类方法被统称为PSF工程。
对于PSF工程，可以通过引入像散、相位衍射光栅和空间光调制器对PSF进行调制，从而提高轴向分辨率和增大成像深度，但是此方法的横向分辨率及其对高密度样品的定位能力会下降。
1）像差
在PSF中引入不具有对称性的像差就可以打破这种局面，实现轴向定位。引入像散的方法光路较为简单，成本低，是目前最受欢迎的方法，但其缺点也很明显。单次成像的定位深度较浅，对厚生物样品进行成像依赖于轴向扫描，信噪比低。若想同时保证信噪比和轴向成像深度，可以使用双物镜。除了使用双物镜,也可以使用光片照明技术提升信噪比。
2）自干涉
自干涉三维超分辨显微镜(SELFI)可以进行三维定位，但其轴向定位深度并没有很大提升。SELFI对像差不敏感，可以让3D SMLM深入完整组织内部进行三维成像。2019年，研究人员实现了SELFI的活细胞三维成像。
3）傅里叶面调制
双螺旋PSF(DH-PSF)进行三维成像可以解决成像深度较浅的问题，但只适用于高亮度的荧光染料和荧光蛋白。这种方法主要是通过使用空间光调制器（SLM）在傅里叶面对PSF进行调制。
2、多位置观测
PSF的横向尺寸在焦平面附近变化缓慢，仅凭单独的2D PSF拟合很难确定其轴向位置。因此，除了采用PSF工程修改PSF形状，也可以使用双/多平面、增加视场角和引入视差的方法进行轴向超分辨，但是此技术存在像差、光子利用效率、系统复杂度和样品制备等多种影响成像质量的因素。
双平面(Biplane)观测最早是由Prabhat于2004年提出，旨在解决无法对不同深度的物体进行同时成像的问题。随后在2007年和2009年，他们对此方法进行了改进，分别提出了如图4所示的多焦面显微镜(MUM)和双物镜多焦面显微镜(dMUM)，用于提升三维成像的轴向分辨能力。
图4 dMUM和MUM系统示意图
想要增大单次成像的定位深度，最直接的办法就是增加平面个数。但是，这也需要在定位精度和平面个数之间权衡，平面个数的增多会让每个平面分配到的光子数减少，导致每个平面的定位精度降低。因此，双/多平面技术直接应用于细胞结构的3DSMLM成像具有一定难度，因此多平面技术也通常和其他技术(如像散)进行结合并且也在3DSPT成像中应用广泛。
另一种实现在不同位置同时观测的方法就是多角度观测，此方法通常表现为在样品基底加入微反射镜、增加视场角或成像光路引入视差。
3、超临界角荧光
众所周知，样品和玻璃界面之间存在折射率不匹配的情况，这对在分界面附近的荧光分子辐射角度分布有很大影响。在距离分界面的一定范围内，荧光分子辐射的一部分荧光会以低于临界角的范围射入玻璃，称为低临界角荧光(UAF)；另一部分荧光则会以超过临界角的范围入射，称为超临界角荧光(SAF)。
为了提升定位精度，超临界角荧光显微镜(SAFM)、光学纳米显微系统(DONALD)、直接超临界角定位显微术(dSALM)等被提出应用在三维显微成像中。除了使用分离UAF和SAF的方法进行三维成像，还可以使用其他系统结构较为简单的方法，例如离焦。但是，离焦产生的像差会影响定位精度和校正曲线的绘制。
对于超临界角荧光，虽然在SAF存在的轴向范围内，这种方法能够达到很高的轴向分辨率，但是超过此范围就无法使用SAF进行定位，需要与其他技术相结合。
4、4Pi显微镜
4Pi显微镜在这四种技术中的分辨能力最高，但是其系统复杂程度也是最高的。在20世纪90年代Hell课题组提出了4Pi显微镜(4Pi microscopy)，如图5所示。在SMLM中使用4Pi可将干涉条纹中的相位信息转化为轴向位置信息，进而提高轴向分辨率，目前已经实现了4通道同时记录相位信息的成像系统。
图5 4Pi-SMLM系统示意图
随后，研究人员提出了干涉测量型PALM(iPALM)，可以清晰分辨出细胞微管、质膜、内质网等细胞结构，但此方法成像定位深度较小；实现多色成像的4Pi-SMS，被应用于人体血小板和哺乳动物微管的三维成像中；为了进一步增大成像深度，一种全细胞4Pi单分子开关纳米显微镜(W-4PiSMSN)被提出。
相比于其他技术，4Pi-SMS的确可以实现很高的分辨率，但是，4Pi-SMS的系统复杂程度较高，成本较高，搭建周期长(通常为1年)，存在较多的不稳定性，因此全世界仅有少数实验室拥有4Pi-SMS，这也限制了4Pi-SMS在世界各地生物实验室中的广泛应用。
5、其他方法
2021年，中国科学院生物物理研究所徐涛院士课题组与纪伟课题组提出了一种新型轴向单分子定位成像技术，并将其命名为轴向定位重复光学选择曝光(ROSE-Z)技术，这是他们基于2019年提出的ROSE技术所进行的改进研究。
在单物镜和3000个光子的情况下，ROSE-Z的轴向定位精度可达2 nm以下，是传统像散方法定位精度的6倍以上，在对细胞微管以及线粒体等细胞结构进行三维成像时均实现了纳米精度的分辨率，且轴向深度为500~600 nm，这也证实了ROSE-Z是一种易于使用且功能强大的三维成像手段。若将ROSE与ROSE-Z相结合并解决定位所需时间较长的问题，则此技术势必会为细胞纳米结构分析提供强有力的帮助。
未来展望
对于受激辐射损耗(STED)三维成像技术，实现三维的快速长时程成像是其一个发展方向，即实现xy-z-t全四维成像。在三维成像时，由于成像空间尺度变大，成像时间变长，光漂白问题加剧。为了减少光漂白，提高成像的信噪比和分辨率，一种方法是使用自适应照明策略，另一种方法是使用特定的荧光标记方法。而若想提高成像速度、缩短成像时间，则可以使用并行STED技术，进行多焦点并行扫描。
将STED技术和其他技术(如定位显微技术、膨胀显微技术和电子显微技术和深度学习技术)相结合，也是其一个发展方向。
对于单分子定位（SMLM）三维成像技术, 从光学的角度来看，改善照明技术可以提升信噪比，从某种程度上也可以提高轴向分辨率、增大成像深度，例如全内反射照明、光片照明和转盘共聚焦照明等其他照明技术；也可以将SMLM与其他超分辨技术相结合，例如Hell课题组提出的MINFLUX和MINSTED，虽然后者并未实现三维成像，但具有很大的可行性。
从生物和化学的角度来看，利用闪烁特性好、量子产率高以及抗漂白能力强的荧光染料也可以得到分辨率较高的SMLM图像，例如PAINT技术、Exchange-PAINT技术和DNA-PAINT技术，其分辨率最高可达到10 nm以下。对算法进行改进，也可以提高分辨率、增大成像深度，特别是在对高密度物体进行成像的情况下，目前已有DeepSTORM3D、ZOLA-3D和SMAP-2018等多种改进后的算法。
此外，通过引入冷冻技术实现超分辨光镜-电镜关联成像也是未来一种研究趋势，例如徐涛院士课题组的cryo-light系统、美国加州理工学院Jensen课题组的cryo-PALM-CET系统和德国马普光科学研究所Sandoghdar课题组的COLD系统等多种技术。
总之，经过时代的发展，超分辨显微成像正在从一系列前沿技术迅速转变为成熟的商业化技术。未来一定会出现更多的新型三维超分辨显微成像技术使科学家能够直接分辨出纳米尺度的生物样品，并同时满足他们其他的特殊需求，许多目前无法由传统分子和细胞生物学方法得到的知识也将会被填补，人们对生命科学将会有更深层次的理解。
本文改写自期刊《激光与光电子学进展》“三维超分辨显微成像技术的研究进展及展望”一文，已获作者授权。
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