作者：龙秋月 郑雅莉 高占成
单位：厦门大学附属翔安医院呼吸与危重症和睡眠医学科；北京大学人民医院呼吸与危重症医学科
引用本文:龙秋月, 郑雅莉, 高占成. 新型冠状病毒检测技术研究进展 [J] . 中华结核和呼吸杂志, 2022, 45(8) : 819-825. DOI: 10.3760/cma.j.cn112147-20220326-00240.
摘要
尽管自然感染或疫苗接种已经初步建立了群体保护屏障，但随着多种新冠病毒变异体的持续出现，突破性感染仍然无法完全避免，新冠病毒检测仍是发现传染源和中断传播链的关键。目前，以核酸、抗原、抗体检测为基础的新冠病毒检测形式呈多元化发展。在相对疫情早期的后新冠时代，复工复产和疫情防控常态化，需要我们根据不同场景的防控需求选择合适的检测手段。本文总结了现有新冠病毒检测技术的原理及其适用特征，以期为临床及公共卫生人员提供精准化决策依据。
严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2，简称新冠病毒）是21世纪继严重急性呼吸综合征（severe acute respiratory syndrome，SARS）和中东呼吸综合征（Middle East respiratory syndrome，MERS）后引发重大公共卫生事件的第三个β属冠状病毒。作为正链RNA病毒，其基因组可编码16种参与RNA转录和复制的非结构蛋白，以及包括刺突（spike，S）蛋白、包膜（envelope，E）蛋白、膜（membrane，M）蛋白、核衣壳（nucleotide，N）蛋白在内的4种主要结构蛋白。2019年末，武汉突发不明原因肺炎，通过病毒分离培养和核酸鉴定技术首次明确了新冠病毒。疫情早期，随着新冠病毒扩散、新冠肺炎病例激增，以核酸为靶标的实时荧光定量聚合酶链反应（real-time polymerase chain reaction，RT-PCR）精准诊断技术对检出阳性个体、阻断传播链、制定防控措施起到了关键作用。在相对疫情早期的后新冠时代，自然感染或疫苗接种逐步建立了抵抗病毒入侵的免疫防线，相当一部分传染源归因于无症状感染，对大规模疑似患者及密切接触群体的快速筛查成为关注重点。在此背景下，基于核酸、抗原和抗体检测的新冠病毒诊断技术多元化，基于成簇规则间隔短回文重复序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）和生物传感器原理等新兴探测手段得到开发应用。本文就已报道新冠病毒检测技术的原理及其适用特征进行综述，以期帮助读者了解并合理选择诊断方式。
一、病毒分离培养
病毒分离培养可用于识别和扩增具备复制能力的活体病毒，长期以来都被视为实验室诊断病毒感染的金标准。临床样本来源的病毒悬液接种于实验动物或病毒嗜性细胞可实现分离毒株的纯化和扩增培养，用于后续鉴定分型和病原学表征。新冠病毒的分离培养必须在生物安全三级实验室进行，鉴于血管紧张素转换酶2（angiotensin converting enzyme 2，ACE2）受体是新冠病毒侵入宿主细胞［1］的关键，现用于培养新冠病毒的主要细胞系为表达丰富ACE2受体的Vero或Vero E6猴肾细胞［2］，同时采用终点滴定法或噬菌斑法，可量化病毒感染滴度。终点滴定法［3］通过观察感染细胞的细胞病变效应来判定50%组织培养感染剂量（TCID50）；噬菌斑法［4］则是计数病毒感染的单个细胞所形成单个噬菌斑，即噬菌斑形成单位（PFU）数量。虽然目前高敏感度和特异度的分子检测技术已成为病毒病原学诊断的主流方法，但出于鉴定和研究新兴病原体（如新冠病毒）的目的，病毒分离培养技术的地位仍不可替代，主要体现在［5, 6, 7］：（1）作为核酸及血清学检测方式性能评估的参考；（2）验证预防、治疗类药物制剂及中和抗体的抗病毒效果；（3）为致病机制研究、流行病学调查和灭活病毒疫苗研发提供毒种资源；（4）明确样本是否具备传染性。然而，新冠病毒的分离培养时长可达4~6 d［8］，安全防护要求高，无法成为疫情形势下尽早筛查疑似患者的常规手段。
二、病毒核酸检测
（一）全基因组测序
基于下一代测序原理的宏基因组（Metagenomic next-generation sequencing，mNGS）技术是目前临床最常用的高通量和实现全基因组测序的病原学诊断方法，可对样本来源的所有DNA或RNA核酸分子进行测序，无需靶标富集和扩增，即可实现样本中细菌、病毒、真菌和寄生虫等微生物基因组的并行表征，具有“无偏泛病原体检测”的特性［9］。新冠病毒的检测由基于RNA的mNGS程序执行［10］，疫情伊始，借助mNGS技术，中国科学家在5 d内即明确了不明原因肺炎的致病原为一种Sarbe亚属的新型β属冠状病毒［11］，进化分析结果显示，其基因组序列与蝙蝠来源毒株最为接近、与SARS冠状病毒同源性高达79%。另外，Mostafa等［12］报道，在mNGS鉴定为阳性的40份鼻咽拭子样本中，RT-PCR仅能检出77.5%（31/40），同时，还发现患者上呼吸道微生物多样性差异与疾病严重程度显著相关。因此，mNGS不仅是追踪病毒进化谱系、表征变异株基因序列和亚单位疫苗研发基础手段，还是精准评价新冠肺炎患者呼吸系统微生态特征性变化的有效工具。然而，该技术的整体工作流程尚无统一标准，其程序的复杂性决定了检测周期至少耗时24 h［13］，平均约48 h甚或更长，对于新冠肺炎患者的早诊断并不占据优势。
（二）基于PCR的核酸检测
基于对病毒遗传物质——核酸序列的扩增，RT-PCR可从混合物中检测到极少量的病毒存在，是新冠肺炎的首选诊断方法和确诊金标准。该技术包括逆转录步骤和聚合酶链式反应［14］，逆转录产物扩增的同时伴随着荧光信号的产生，由此形成可量化反应系统被热循环仪捕获。荧光值达到界定阈值时的循环数被称为阈值循环［15］（Cycle threshold，Ct），是判断核酸检测结果的重要参数，Ct值越低，代表样本中病毒负荷越高。世界卫生组织（WHO）于2020年中公布了多国权威机构针对N、E、RdRP和ORF基因设计的引物和探针靶向序列，随后Jung等［16］的研究表明，这些引物-探针组合对新冠病毒均具有高度特异性，且未观察到与其他呼吸道病毒存在交叉反应。目前，我国推荐将N基因和ORF1ab基因并行作为新冠病毒核酸检测的靶标［17］，同一样本满足双靶标阳性或单靶标重复检测阳性则可判定为阳性结果。相对来说，S基因序列在已报道的变体中属于突变高发区［18］，虽不适于作为新冠病毒变体诊断的通用靶标，但对于突变位点的鉴定和各类变体的识别却大有裨益。Xiong等通过数据库比对分析鉴定出Alpha和Delta病毒株S基因的特征性突变C1709A，由此设计了靶向引物使得RT-PCR可用于以上两种变体的特异性诊断［19］。
值得一提的是，数字PCR（Droplet digital，dPCR）是以有限稀释为基础、以泊松分布为原理、以绝对定量为核心的第三代PCR技术［20］。其不受反应效率和引物特异性影响，无需外部对照即可获得绝对定量。在相同实验条件下，dPCR对新冠病毒ORF1ab和N基因的检出极限分别为2.1和1.8 个拷贝/ml，而RT-qPCR分别为1 039和873.2个拷贝/ml［21］。相关临床研究表明［22, 23］，尽管dPCR的拷贝数与RT-PCR的Ct值高度相关，但前者报告的假阴性结果更少，对于低病毒载量样本的检测是更为灵敏和准确的工具。我国《2019新型冠状病毒核酸检测专家共识》［24］提及，当核酸检测Ct值介于灰度区时，可采用敏感度更高的dPCR方法进一步确定。但鉴于高成本和低通量的局限性，dPCR并未在临床病原学诊断中普及。
（三）基于等温扩增的核酸检测
相较于PCR技术，等温扩增核酸检测简化了热循环反应过程，缩短了检测周期。以环介导等温扩增（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP）［25］为例，该方法利用4~6个引物识别目标序列的不同区域，在恒定温度（60~65 ℃）下通过茎环结构进行反复扩增，1 h合成的目标基因多达109拷贝。用于新冠病毒的核酸检测的LAMP技术增加了逆转录步骤，在此基础上，将副产物焦磷酸镁引起的浊度变化放大［26］，则可通过浊度计判断扩增结果，同一研究还证实，LAMP与RT-PCR具有相似的敏感度。其他研究［27, 28］也表示，LAMP方法用于新冠样本检测可达到90%~100% 的敏感度和95%~99% 的特异度，同时多靶标还提高了扩增的准确性，检测时间却仅需30 min。此外，新冠病毒变体Alpha、Beta、Gamma、Delta和Omicron在N基因12~213碱基序列区高度保守，Luo等据此优化了引物设计［29］，使得LAMP技术对新兴变体的诊断具有兼容性。其余等温扩增核酸检测方法还包括重组聚合酶扩增、滚环扩增和基于核酸序列扩增［30］，但在新冠病毒诊断方面的应用相对少见。综上，等温扩增技术具备高特异度、高敏感度、高效率、设备简化的优点，但其多引物、多酶的反应体系需求同时也加大了检测设计和研发的复杂程度，我国药监局批准的新冠病毒核酸检测试剂盒中仅有两款采用了等温扩增技术。
（四）基于CRISPR的核酸检测
CRISPR的原理为向导RNA（guide RNA，gRNA）引导下实现的Cas蛋白酶核酸剪切功能。具体来说，根据新冠病毒的RNA序列可设计特异性靶向gRNA，理论上，只要样本中存在病毒靶向序列，gRNA就能对其进行精准识别并激活Cas蛋白酶执行报告核酸分子切割功能，使得信号分子得以释放、捕获。张锋团队利用CRISPR-Cas 13a系统开发的SHERLOCK技术［31］是该领域的典型代表，结合重组聚合酶等温扩增技术，在术前患者筛查中平均检测耗时约70 min，检出下限为42拷贝/ml，荧光读数的特异度和敏感度均达100%，侧流读数分别达100%和97%［32］；为简化流程，该团队还采用了LAMP法将RNA扩增和Cas酶切割步骤合二为一，不到1 h即完成了核酸检测，检测限为RT-PCR的三十分之一（33拷贝/ml和1 000拷贝/ml）［33］。在此基础上，de Puig等设计了靶向新冠病毒变体突变序列的gRNA，拓展了该技术在即时鉴定N501Y、E484K 等变体相关突变位点方面的应用［34］。另外，Broughton及其同事报道了第一个基于CRISPR-Cas 12系统的DETECTR技术［35］，实现了45 min内对新冠病毒的定性检测。Liang等利用该技术开发了新冠病毒S基因分型的多重检测，实现了Alpha、Beta、Delta变体的快速鉴别［36］。CRISPR的酶反应特质和gRNA选择赋予了该技术高敏感度、高特异度和灵活靶向性的优势，但其优良效能应用于临床诊断的普适性仍有待证实。
三、病毒抗原检测
核酸检测和抗原检测都是直接靶向新冠病毒的检测方式，前者用于检测感染早期阶段活跃复制的病毒，而后者则利用特异性抗体对病毒特定蛋白进行鉴定。N蛋白在进化上高度保守，是新冠病毒抗原检测的主要靶标［37］。现今报道的抗原检测多基于侧流免疫反应（Lateral flow immunoassay，LFIA）原理，这是现场即时检测（Point-of-care tests，POCT）的最主流形式，15 min左右即可获得结果［38］。该技术通过毛细流驱动样本液滴流过层析条（图1），样本中的待测分子（特定抗原）会先与结合区中的一部分标记分子联结，检测条带（T）区可捕获待测分子-标记分子联结体并与其反应转换为颜色信号，以定性检测特定抗原；而质控条带（C）区可与未联结的标记分子反应，以反映同一检测的质控水平［39］。我国于2022年3月上市的第一批新冠病毒抗原自测试剂盒均以LFIA原理为基础，不同之处在于其采用的标记分子和信号读取设备不一，可选择胶体金、乳胶微粒或荧光分子。快速抗原检测的敏感度与病毒载量相关，在无症状感染者中证据仍然有限［40］。研究发现［41］，在Ct值低于25的样本中，敏感度为97%~100%；在Ct值介于25~30的样本中，敏感度为50%~81%；而在Ct值高于30的样本中，敏感度低至12%~18%。相应的，WHO关于新冠病毒快速抗原检测的文件［42］指出，快速抗原检测的结果在存在社区传播的地域最为可靠。因此，抗原检测无法替代核酸检测成为确诊标准，然而，对于不具备核酸检测能力的基层卫生机构、感染风险相对较高的社区居民和大规模复工复产人群，抗原检测是低廉、便利的有效筛查工具，有助于早发现病例，早中断传播。
图1侧流免疫反应（LFIA）原理示意图
四、抗体检测
新冠病毒入侵人体后，固有免疫和适应性免疫系统相继激活，通常在感染后1~2周内，病毒特异性IgM抗体出现继而缓缓衰退，而在感染2周左右，IgG抗体产生并可在体内维持较长时间，故IgM可用于提示近期感染，IgG则可用于提示既往病毒感染史。N蛋白和S蛋白S1亚基具有强免疫原性，是新冠病毒血清学检测中最常见的生物标志物［43］。我国第九版诊治指南指出［8］，特异性IgM抗体和IgG抗体均为阳性者可确诊新冠肺炎。但新冠疫苗接种者或既往感染新冠病毒者也会发生血清学转换，故而该指标对其无诊断性参考意义，仅可作免疫屏障建立后评价体液免疫反应的重要工具，如测定抗体水平随时间推移的衰减程度和针对变异毒株的抗体有效性。血清学检测的常见方法包括酶联免疫吸附试验（Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）、化学发光免疫分析法（Chemiluminescence analysis，CLIA）和以LFIA原理的POCT设备。ELISA是一种基于微孔板的测定技术，可实现肽段、蛋白质、抗体等分子的定性或定量检测，检测周期1~5 h［44］。孔板中包被的病毒抗原可与样本中特异性抗体发生特异性结合，随后抗原-抗体复合物同标记分子相连即可产生与抗体浓度呈正相关的比色或荧光信号。CLIA法采用化学发光强度来量化样本中的抗体水平，具有高信号强度、宽检测范围、无散射光干扰的优势［45］，每24小时可以执行上4 000次检测［46］。研究表明［47, 48］，CLIA应用于检测多抗原的特异性高于单抗原，用于检测总抗体水平时效能最好。至于LFIA产品，其便携、效率高且样本量仅需几微升，适用于指尖采样［49］。然而，无论何种血清学检测技术，其效能都与采样时间密切相关，Nicol等［46］使用ELISA、CLIA和LFIA技术针对293例样本的IgG进行了评估，发现以上方法均在确诊14 d后敏感度最高，达100%；Pickering等［50］也报道了抗体检测在首发症状后20 d采集的样本中具有最高的敏感度和最窄的置信区间。因此，鉴于血清学转换时间窗约1~2周，血清学检测在疾病初期诊断新冠肺炎的效用有限。
五、基于宿主呼吸代谢物的检测
宿主呼出气体代谢物的检测被称为呼吸分析，是一种随代谢组学兴起的无创且实时的POCT方式，通过质谱-色谱技术检测关键挥发性有机化合物（Volatile organic compounds，VOC）实现，具有明确诊断和大规模筛查的潜力。在呼吸道感染、阻塞性肺病及肺癌等领域，宿主代谢微环境的扰动对于肺部疾病发生发展的重要作用已有所阐明［51］。Grassin-Delyle等［52］对新冠肺炎患者的呼出气代谢物进行了表征，发现其中4种VOC（甲基戊二烯醛、2，4-辛二烯、1-氯庚烷和壬醛）可用于有效区分新冠相关急性呼吸窘迫综合征与非新冠急性呼吸窘迫综合征，在40例测试患者中，敏感度和特异度分别达90%、94%。另Chen等［53］通过以丙酮占主导的12种VOC成功区分了新冠患者和健康对照，且该诊断模型可检测出核酸检测呈假阴性的感染者。美国食品药品监督管理局（FDA）于2022年4月颁发了首个用于判断新冠病毒感染的呼吸分析仪（InspectIR）的紧急使用授权，其主要检测呼出气体中新冠病毒感染特征性的5种酮类和醛类VOC，代谢物检测限为10ppb，3 min内即可获得结果［54］。在一项纳入了2 409例确诊新冠肺炎患者（PCR阳性率仅为4.2%）的大型队列中，该技术被证明具有91.2%的敏感度和99.3%的特异度，且阴性预测值高达99.6%；此外，针对Omicron变体检测，该技术具有90.9%（10/12）的相似敏感度［55］。需注意的是，FDA指出，该项测试可用于筛查暴露史不明确的无症状个体，但不能作为患者管理和治疗的唯一决策依据，其结果应同个体临床症状和体征、分子诊断报告综合考虑。
六、新兴生物传感器
生物传感器是一种对生物物质敏感并通过理化换能器及信号放大器将其浓度转换为电信号进行检测的仪器，旨在优化现有生物分子检测手段。对于核酸检测，Peter等基于CRISPR-SHERLOCK技术研制了可穿戴的生物传感器［56］，将该技术集成至标准口罩中检测呼出气溶胶内的新冠病毒，在90 min内给出的准确度可与金标准RT-PCR相媲美。最近Wang等［57］还报道了基于石墨烯场效应晶体管的微机电传感系统，无需核酸提取和扩增步骤，在33份鼻咽拭子样本中（Ct值24.9~41.3）不到4 min即可对新冠病毒进行鉴别；同时在54份阴性样本中未出现假阴性结果，检测限低至10~22拷贝/ml。对于抗原检测，Raziq等［58］首次以分子印迹聚合物作为生物靶标识别元件，开发了针对新冠病毒N蛋白的电化学传感器，反应时长15 min，检测限和定量限分别达15 fM和50 fM（0.7~2.2 ng/L），与真实世界样本中的抗原浓度匹配。对于血清学检测，Elledge等报道了一种基于分裂式荧光素酶-目标抗原融合蛋白的抗体检测方法［59］，靶向抗新冠病毒S蛋白（S-Sensor）和N蛋白（N-Sensor）抗体，可在30 min内实现血液、唾液中低水平抗体的定量分析。在对临床样本的验证中，N-Sensor和S-Sensor的特异度分别达99.2%、100%，敏感性分别达98%、89%，且与季节性冠状病毒样本未发生交叉反应性。上述模块均可搭载于便携装置以朝POCT设备方向改造，因此，综合时效性、简便性、特异度、敏感度来看，生物传感器有望发展成为社区筛查甚至是临床实验室诊断的高效工具。
七、总结与展望
随新冠疫苗的大范围接种，群体免疫屏障基本建立，然而，适应宿主的新型变异毒株不时更迭，突破性感染的发生难以完全避免，在疫情防控常态化的形势下，新冠病毒的检测仍是发现传染源和部署公共卫生策略的基石。不同检测手段各有侧重（表1［19，27, 28, 29，33, 34，36，46，50，60, 61, 62, 63, 64］），互为补充，但在实际应用中仍需结合流行病学史、临床表现和基础疾病等综合考虑以避免误判。从生物靶标来看，核酸检测和抗原检测分别以病毒遗传物质和功能分子为靶标，抗体检测和呼吸分析则以人体病毒特异性免疫反应或代谢变化为靶标；从检测时间线来看，核酸检测和快速抗原检测在急性期即可用于诊断新冠病毒感染，其中，前者具有相对更低的检出下限，抗体检测则于起病1~2周发生血清学转换后效能最好；从适用特征来看：（1）基于核酸扩增检测的分子诊断技术敏感度高、特异性强，仍是明确新冠病毒感染的首选，LAMP技术有潜力成为RT-PCR的替代；（2）抗原检测和呼吸分析在操作性和时限性方面占据优势，是基层医疗机构分流和大规模人群筛查的便捷方式，有助于确保社会活动的正常运转；（3）血清学检测是病程中后期的重要诊断工具，也是监测抗体反应的基础手段；（4）新兴CRISPR技术和生物传感器策略综合实力优异，应用前景广阔，有待于在大样本临床队列中得到印证。
后新冠时代的阳性病例可能以无症状或潜伏期感染者常见，低病毒载量情况下敏感度偏低的检测方法（如快速抗原检测）检出率或会下降，与此同时，鉴于新冠病毒适应性突变的持续，基于高度保守序列的普适性检测和基于特征性突变位点的变体诊断需统筹兼顾。因此，单一检测技术无法成为兼具高效能和高效率的理想诊断方式，病毒导向性和宿主导向性的联合检测策略可随场所变换、病期推移和变体更迭为病例监测和疫情防控提供多重保障，是后新冠时代新冠病毒检测的演变趋势。
参考文献（略）
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