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A Broad-Specifificity Chitinase from Penicillium oxalicum k10 Exhibits Antifungal Activity and Biodegradation Properties of Chitin”通讯作者为湖北大学生物催化与酶工程国家重点实验室康立新博士等人。
从土壤中分离到的草酸青霉k10显示了虾甲壳素的水解能力和对菌核菌的抗真菌活性。从含几丁质酶的粉末培养基中制备出k10几丁质酶，并经硫酸铵沉淀和柱层析纯化。纯化的几丁质酶在pH值为5和40℃时对胶体几丁质的活性最大。钾和锌增强酶活性，银、铁、铜抑制酶活性。该几丁质酶可将胶质几丁质转化为N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)、(GlcNAc)2和(GlcNAc)3，表明该酶具有内渗和外渗活性。此外，几丁质酶抑制了植物病原真菌菌核菌和环状菌的菌丝生长。这些结果表明，k10是生产几丁质酶的潜在候选物，可用于从几丁质废物中生产几丁质寡糖，并作为一种杀菌剂。
几丁质酶产生菌株的分离与鉴定
几丁质酶可以将几丁质分解成简单的分子，用于细胞应用。此外，几丁质是真菌细胞的主要成分之一，抗真菌活性被归因于分泌的几丁质酶裂解真菌细胞壁。本研究基于上述特性，分离出了产生几丁质酶的菌株。以粉末状几丁质为唯一碳源，分离出有效的几丁质降解菌株。从虾废弃物处理场分离出20株真菌，其中5株具有较高的几丁质酶活性。k10菌株的几丁质酶活性最高（4.2U/mL）。利用k10菌株进一步研究了其对菌核菌的拮抗作用，并具有良好的抑制活性（图1）。为了进行分子鉴定，我们对k10的一个571bp的内部转录间隔区(ITS)进行了测序和BLASTed。结果表明，k10ITS与几株草酸菌的序列同源性为100%。MT588795.1、MT529129.1和MT446169.1。
k10菌株对菌核菌菌丝生长的拮抗特性。将k10菌株的孢子接种在距离菌核菌菌落边缘1.5cm处，并在28℃下孵育。
几丁质酶生产培养条件的优化
为了研究培养条件对草酸磷k10生产几丁质酶的影响，采用4种几丁质材料和4种氮源对几丁质酶进行发酵。如图2A所示，胶体状几丁质和粉末状几丁质是最适合生产几丁质酶的底物，其活性较高。因此，考虑到生产成本，我们选择粉末几丁质作为进一步研究的优良诱导剂。图2B显示，色氨酸是最适合生产几丁质酶的氮源。此外，含有3%粉末几丁质和4%色氨酸的基础培养基最适合在28℃和pH5条件下生产几丁质酶，持续3天(图2C-f)。此外，几丁质酶活性受到生产培养基中添加碳的影响，并加入玉米淀粉，其活性在37U/mL时达到峰值(图2G)。
在各种研究中，胶体几丁质被广泛用作生产几丁质酶的诱导剂。例如，粘质沙雷氏菌PRNK-1中几丁质酶的表达。PR-M6和地衣芽孢杆菌B307在0.5%(w/v)胶质中孵育。天冬氨酸酶。YS2-2、赤木霉PQ34、黄粘球菌UM01和无色杆菌对1%胶体几丁质的反应。绿木霉、猪链霉菌KLSL55和嗜水蛭B-DZ44的几丁质酶产量分别为胶体几丁质的1.4%、1.5%和2%。胶体甲壳素是经酸碱化学试剂（氯化氢、氢氧化钠）处理得到的甲壳素的衍生物，生产成本高，造成环境污染。为了解决这一问题，人们用粉末状的几丁质和虾壳来生产几丁质水解酶。几丁质和胶质几丁质的适当比例可提高几丁质酶的生产水平，最佳浓度为7.49g/L几丁质和4.91g/L胶体几丁质。高糖芽孢杆菌在虾壳培养基上培养4天，产生耐热的几丁质酶。本研究选择粉末状几丁质作为几丁质酶生产的诱导剂，具有工业应用成本低的优点。
几丁质酶纯化
几丁质酶在70%的硫酸铵浓度下从培养上清中有效沉淀。经过透析和Sephadex-75尺寸排除层析，得到了8个含有酶活性的组分。获得约190mg k10几丁质酶，用Sephadex柱纯化后，酶比活性提高到162.1U/mg（表1）。在几丁质生长细胞的细胞培养上清中，检测到一个主要的蛋白带（图3，第2道），分子量约为45kDa（图3，第3道）；而对于没有几丁质生长的细胞的培养上清，显示了非常低的信号强度（图3，第1道）。用酶谱法证实了该蛋白的几丁质酶活性（图3，第4道）。
温度和pH对几丁质酶及动力学参数的影响
经过纯化后，测定了酶学的表征。纯化的几丁质酶在40℃下表现出最大的活性（100%）(图4A)。在40℃孵育60min时，酶的活性保持在90%以上，但在50℃孵育60min时下降到70%，在60℃孵育10min时下降到35%(图4B)。最佳温度与PQ34、几丁菌CT01和枯草芽孢杆菌的其他几丁质酶相似。K10几丁质酶在pH中的活性在4~7之间，在pH为5.0时具有最佳活性(图4C，D)。KB-DZ44、枯草芽孢杆菌、链霉菌ATCC27414和的几丁质酶的pH值相似。用胶体几丁质底物测定了几丁质酶的动力学值，得到Km为12.56mg/mL，kcat为0.22s−1，Vmax为1.05µM min−1mg−1蛋白。第1h的平均活性近似初始活性，1h的酶活性降低了10%。
k10几丁质酶的底物特异性
为了进一步研究几丁质酶的特征，我们测定了底物的特异性。最高的活性被定义为100%。K10几丁质酶对胶体几丁质的活性最高（表2）。与胶体几丁质相比，粉末状的甲壳质、超几丁质、超细化的几丁质、虾壳粉和90%去乙酰化甲壳糖的相对活性分别为42.6%、58.3%、15.7%和11.4%。
几丁质酶的抗真菌活性
采用菌丝延伸法检测了k10几丁质酶对植物病原菌、菌核菌和环孢杆菌的抗真菌活性。如图7所示，与对照组相比，k10几丁质酶具有抑制活性，对菌核菌和环状大肠杆菌表现出明显的菌丝生长抑制区。这些结果表明，k10菌株对菌核菌的拮抗特性与几丁质酶的产生有关。
由于几丁质是真菌细胞壁的关键成分，因此几丁质酶在植物防御真菌病原体中起着重要的作用。几丁质酶的抗真菌活性已在不同的研究中被观察到（表4）。与已报道的几丁质酶类似，草酸属几丁质酶的抗真菌活性使其成为控制植物疾病和有害食品真菌的生物活性物质。
作者分离到一株能降解几丁质并具有几丁质酶活性的草酸杆菌k10菌株。用k10降解粉末几丁质素可以生产几丁质酶。K 和Zn2 是几丁质酶活性的启动子，Cu2 、Fe2 、Ag 、碳酸胺、EDTA、β-巯基乙醇和SDS是抑制剂。薄层色谱结果表明，k10几丁质酶具有内渗和外渗特性。主要的酶解终末产物为(GlcNAc)2、(GlcNAc)3和少量的GlcNAc。此外，几丁质酶对菌丝菌和菌丝菌的生长有明显的抑制作用。结果表明，草酸几丁质酶是一种很好的几丁质废物生物转化剂，可作为杀菌剂利用。
整理：高放
DOI:.org/10.3390/md19070356
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