点评 | 王久存教授（复旦大学）、刘光慧研究员（中国科学院动物所）、王福俤教授（南华大学/浙江大学 ）
撰文 | 杨宇（复旦大学 博士）
能量是维持生命系统复杂性及有序性的基础，作为具有独立基因组DNA的半自主细胞器，线粒体是包含人类在内的几乎所有真核生命的能量代谢中枢【1】。在衰老过程中，线粒体的功能显著下降并导致细胞能量代谢稳态失衡，进而促进衰老及相关疾病的进程【2】。但伴随衰老进程线粒体功能下降的核心原因尚未有明确定论，其中一个重要假设即是：伴随着衰老进程线粒体DNA (mtDNA) 突变会不断累积，而由于mtDNA编码了线粒体氧化磷酸化所需的部分核心蛋白，因此mtDNA突变积累到一定程度后可导致线粒体及细胞功能的异常，促进衰老及相关疾病的发生。由于mtDNA突变具有高度的细胞间异质性，而传统的混合细胞测序（Bulk sequencing）技术会导致单个细胞中的高频突变被平均化而无法被测到，极大地限制了我们对于细胞中mtDNA突变频率和突变谱的认识。因此，开发相应技术以在单细胞层面探究mtDNA突变与个体细胞衰老及相关疾病的关系尤为重要。近日，康奈尔大学顾正龙教授（现就职于复旦大学和粤港澳大湾区精准医学研究院（广州））团队，在PNAS上在线发表了题为 High-frequency and functional mitochondrial DNA mutations at the single-cell level 的研究论文，通过使用自主开发的低成本的单细胞mtDNA深度测序技术（scSTAMP，多重探针靶向扩增的单细胞mtDNA测序）对健康老年个体的B淋巴细胞及单核细胞进行单细胞mtDNA深度测序，首次揭示老年个体体细胞中mtDNA突变具有远高于预期的高频性、有害性及异质性，为衰老过程中线粒体功能下降现象提供了新的机制解释，并为衰老及相关疾病的干预及治疗提供了新的研究方向。为更准确地评估细胞内mtDNA突变率及其对细胞功能的影响，研究团队首先基于基于前期自主开发的STAMP (Sequencing by Targeted Amplification of Multiplex Probes) 技术【3】，开发了低成本的单细胞mtDNA靶向测序技术（scSTAMP）（图1）。基于该技术平台，研究团队获取了同一受试者的24 个B淋巴细胞（代表淋系）和24个单核细胞（代表髓系），将其裂解液分成两份，分别进行文库构建及深度测序，发现两者之间的突变谱具有高度的一致性，成功验证了scSTAMP技术检测单细胞水平mtDNA突变的可靠性。图1 单细胞mtDNA靶向测序技术（scSTAMP）的技术原理为进一步系统探究老年个体细胞中mtDNA的突变图谱，并评估mtDNA突变对细胞功能的潜在影响，研究团队运用scSTAMP技术对来自一名76岁捐献者的各768个B淋巴细胞及单核细胞进行了超高深度（平均测序深度大于640X）mtDNA测序。研究团队在这些B淋巴细胞的416个mtDNA位点中鉴定到了473个突变频率超过20%的突变，而在这些单核细胞的439个mtDNA位点中鉴定到了503个突变频率超过20%的突变，平均每个B淋巴细胞和单核细胞中存在0.658个和0.712个高频mtDNA突变位点。进一步分析发现，318个（50.3%）B淋巴细胞及346个（56.1%）单核细胞中至少具有一个高频mtDNA突变（>20%）。有趣的是，绝大多数B淋巴细胞（93.8%）和单核细胞（90.2%）中检测到的mtDNA突变位点都只出现了一次，说明老年个体体细胞的mtDNA突变具有高度的细胞间异质性及随机性。同时，还发现24.3%的B淋巴细胞和17.5%的单核细胞具有至少一个突变频率高于90%的高频突变位点（图2）。上述结果表明，高频mtDNA突变在衰老个体的B细胞和单核细胞中广泛存在。图2 B细胞和单核细胞中存在广泛的mtDNA突变在上述研究基础上，研究团队对鉴定到的单细胞mtDNA突变进行了深入研究（图3），发现90%以上的mtDNA突变均定位于蛋白编码基因及tRNA基因区，且定位于蛋白编码基因的mtDNA突变中，绝大部分（>75%）均为非同义突变。为进一步评估上述mtDNA突变的有害性，研究团队利用CADD (The Combined Annotation Dependent Depletion scores)数据库，发现B细胞中的52.2% 的错义突变及单核细胞中 59.6%的错义突变的分值均大于20，表明这些mtDNA突变具有较高的致病性，提示细胞内广泛的mtDNA突变有可能显著影响线粒体的功能，促进细胞及个体的衰老。文章还比较了两种细胞之间的突变差异。
顾正龙教授简介和博士后招聘启事：
https://www.ipm-gba.org.cn/Index/news_details/id/233.html
专家点评
王久存（复旦大学 教授）
衰老是一个以细胞功能逐渐退化为标志的过程，其中线粒体功能衰减被认为是衰老的重要标志。线粒体是所有真核生物共有的细胞器，被称为细胞的“发电站”，对于维持细胞的生存至关重要。线粒体还参与细胞分化、细胞凋亡、免疫反应等重要过程，并与神经退行性疾病、心血管疾病、糖尿病等慢性疾病密切相关。线粒体自带一套遗传物质-线粒体DNA（mtDNA），mtDNA主要编码电子传递链的亚基，其编码区占比达95%，远高于核基因组的1%。
线粒体功能随年龄增加而衰减的原因十分复杂，mtDNA突变增加、拷贝数减少等都会造成线粒体功能衰减。与核基因组为二倍体不同，根据代谢是否旺盛，人类细胞中存在几百到数千不等的线粒体，每个线粒体中又存在多个mtDNA拷贝，因此mtDNA突变存在异质性强的特征，需要专门的技术手段解决这一问题。单细胞测序技术适合解决mtDNA多拷贝、异质性强的问题，但相关领域尤其是衰老过程中单细胞层面线粒体DNA突变特征的研究较少，同时缺乏高性价比的实验与分析流程。
在近期发表于PNAS杂志的研究中：High-frequency and functional mitochondrial DNA mutations at the single-cell level，复旦大学粤港澳大湾区精准医学研究院（广州）顾正龙教授团队利用自主研发的单细胞mtDNA测序技术（scSTAMP），对两个老年个体的约1,500个B淋巴细胞和单核细胞进行了线粒体DNA测序。结果显示，在单细胞水平上普遍存在着mtDNA的高频致病性突变。超过50%的细胞至少携带一个mtDNA突变，变异等位基因频率（VAF）超过20%。令人惊讶的是，超过20%的观察到的突变在两个细胞群中的VAF均超过90%。此外，超过60%的突变位于蛋白编码基因中，其中70%以上为非同义突变，并且超过50%的非同义突变被预测为高度致病。这说明具有功能意义的mtDNA突变可能在个体高龄时普遍存在。
这一结果表明，以前未被重视的单细胞mtDNA突变的异质性可能在人类疾病和衰老中发挥重要作用，并强调了在单细胞水平研究年龄相关的mtDNA突变动力学的重要性。与同类技术相比，该研究中开发的基于单细胞的scSTAMP技术具有较高性价比、更高的准确度和对低频突变检测的敏感性。
该研究还讨论了mtDNA群体遗传的微进化过程，细胞内数千个mtDNA的突变过程可以近似成一个简单的群体遗传学模型。在年老个体中，单细胞层面mtDNA突变可能因为线粒体功能的减弱而受到较为松弛的选择压力，从而累积到高频，而高频的mtDNA突变可进一步影响线粒体功能并累积到更高频率。这一微进化过程也会受到线粒体遗传背景即线粒体单倍型的影响。该研究在单细胞层面上探索了年老个体的线粒体DNA突变图景，并提示了单细胞mtDNA突变的异质性在人体衰老中的重要作用。
专家点评
刘光慧（中国科学院动物研究所 研究员）
伴随衰老进程的线粒体功能下降可能是驱动个体细胞衰老及相关疾病发生发展的核心原因之一。但是，对于导致相应进程的线粒体功能下降的核心原因，却一直没有定论，一个猜想是：由于氧化应激等原因，线粒体DNA（mtDNA）更容易发生突变并伴随衰老进程而累积，而由于mtDNA编码了线粒体氧化磷酸化复合体的部分核心组分，mtDNA的突变积累势必会造成线粒体及细胞功能的异常，进而促进衰老及相关疾病（如神经退行性疾病、癌症等）的发生发展进程。但是，由于后天性的mtDNA突变具有细胞间异质性，以往的基于混合细胞测序（Bulk sequencing）技术会导致单个细胞中“可能存在”的高频突变被平均化而无法被准确地检测及评估，从而使得人们错误地低估了mtDNA突变在衰老个体细胞中的累积程度及其对细胞及个体衰老的作用。因此要准确评估体细胞中mtDNA的突变谱及其对细胞功能的影响，开发单细胞的mtDNA测序技术则显得尤为重要。虽然近年来已有多项单细胞DNA测序技术及研究成果的发表，但由于这些技术及研究更多地聚焦于全基因组的研究，因此在成本可控的情况下导致mtDNA的测序深度不够，不足以准确评估个体细胞间mtDNA突变的异质性。针对上述科学及技术难题，顾正龙教授课题组在其最新成果中成功开发了低成本的、高测序深度的单细胞线粒体DNA靶向测序技术（scSTAMP），并将其应用于老年个体大量体细胞的mtDNA测序，研究发现在老年个体的B淋巴细胞及单核细胞（monocytes）中，广泛存在着大量高频、致病性的mtDNA突变，且具有高度的细胞间异质性。由此在一定程度上验证了“mtDNA突变在衰老个体细胞中高度累积，且mtDNA突变是导致线粒体及细胞功能异常，进而促进个体细胞衰老及相关疾病发生发展的驱动因素”这一科学假说。通过顾正龙教授课题组的这项研究，不仅开发了具备高效价比的单细胞线粒体DNA靶向测序技术，并为更大人群、更多细胞类型的单细胞mtDNA测序研究及潜在的临床应用提供了有力工具。同时，该研究揭示了mtDNA突变在老年个体体细胞中具有远超预期的高频性及有害性，为衰老过程中线粒体功能下降的原因提供了一种机制解释，表明干预mtDNA突变的产生及积累将成为预防及治疗衰老相关疾病的一个潜在但重要的研究方向。专家点评
王福俤 （南华大学/浙江大学 教授）
线粒体作为细胞的能量工厂，不仅是细胞的代谢中心，同时也调控细胞生长和各种细胞死亡过程如凋亡、坏死、焦亡、铁死亡和铜死亡等。线粒体与多种疾病的发生都有直接联系，包括神经退行性疾病、自身免疫性疾病和癌症等。线粒体内的遗传物质-线粒体DNA（mtDNA）存在多个拷贝。相比于细胞核基因组，mtDNA由于缺乏核膜以及组蛋白等结构保护，使得mtDNA突变率远高于核基因组。此外，由于线粒体内缺乏类似于细胞核基因组的系列修复机制，且伴随细胞分裂过程的不均等分配机制使得突变会不可避免地在细胞中累积，且存在细胞间的异质性。因此，细胞mtDNA突变被认为是引起线粒体功能异常的重要因素。由于缺乏单细胞层面的线粒体DNA深度测序技术，目前对于细胞内部的线粒体DNA突变谱仍无法进行精确测量。顾正龙团队在本项研究中自主研发的新型超深度单细胞线粒体DNA测序方法scSTAMP，同时对老年个体的两种不同来源的免疫细胞进行单细胞线粒体测序，全面探索并验证单个细胞内线粒体DNA突变异质性的差异，同时也通过单细胞mtDNA测序揭示了致病性mtDNA突变在老年个体单个细胞内的高频分布。值得一提的是，与炎症性疾病相关的多种细胞死亡方式，包括凋亡、坏死以及铜死亡等都被报道与线粒体氧化应激和TCA循环失衡导致的蛋白质毒性应激相关。线粒体DNA突变导致的线粒体氧化应激和多种金属离子累积导致的线粒体损伤已在包括肝损伤、心脏病、肠炎等许多疾病类型中被发现。借助此项研究中的低成本单细胞线粒体DNA测序技术对线粒体相关疾病患者进行单细胞线粒体测序分析，对于寻找疾病可能的致病突变，发现新的致病机理具有重要的意义。原文链接：
https://www.pnas.org/doi/10.1073/pnas.2201518120
制版人：十一
参考文献
1. Picard, M. and O.S. Shirihai, Mitochondrial signal transduction. Cell Metab, 2022. 34(11): p. 1620-1653.
2. Cai, Y., et al., The landscape of aging. Sci China Life Sci, 2022: p. 1-101.
3. Guo, X., et al., STAMP: a multiplex sequencing method for simultaneous evaluation of mitochondrial DNA heteroplasmies and content. NAR Genom Bioinform, 2020. 2(4): p. lqaa065.
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