单细胞悬液的质量直接关联着单细胞测序实验的结果，对后续组学研究产生深远的影响。针对不同的样本类型，如何制备高质量的单细胞悬液是关键，有些组织往往会因为组织结构复杂、脂肪或酶含量高、脆弱等原因，并不适合解离成单细胞悬液。为了避免这些问题，可以通过将组织直接分离细胞核的方法来进行单细胞多组学的研究。我们基于长期积累的丰富经验和专业操作，可以将多数样本类型制备成高质量的单细胞核悬液，为了让您能拿到满意的结果，本期将分享一些抽提核制备悬液的经验给大家。
制备单细胞核悬液步骤
单细胞核悬液的制备并不复杂，首先将新鲜或冻存的组织切成小块（一般为2–3 mm3），加入裂解液，用匀浆器将组织匀浆。清洗过滤后，用台盼蓝或荧光染料染色，在显微镜下观察细胞核的质量和样品中细胞碎片的多少，并对细胞核的数量进行初步计数。密度梯度离心或流式分选的方法，去除细胞碎片。最后将细胞核用台盼蓝或荧光染料染色，并在显微镜下检测细胞核的状态。
推荐抽核的样本
以下的样本因为细胞结构形态的原因制备成单细胞悬液的效果不佳，更推荐抽核来测序。
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组织类型 |
不推荐制备成单细胞悬液的原因 |
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心脏，肌肉，脂肪，巨核细胞 |
细胞直径大于40μm，会造成捕获芯片堵塞 |
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肝脏 |
肝实质细胞太脆弱处理过程中容易破裂 |
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脑神经 |
组织中含有大里髓鞘结构，消化过程 中会产生过多的杂质背景 |
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胰腺，甲状腺 |
组织自身含酶里高，组织解离过程中 易导致细胞活性较差 |
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冻存组织（新鲜组织无法立即取材，珍贵的临床样本） |
组织冻存后细胞膜受损，无法得到 合格的单细胞悬液 |
制备时需注意
1. 对于冰冻组织，在抽核之前须先提取组织的RNA，用2100检测RIN值。如果RIN值大于7，说明样品中RNA质量较好，可以用于单细胞核转录组测序。
2. 在抽核过程中，每一步都用台盼蓝或荧光染料染色，在高倍显微镜下观察细胞膜是否裂解，细胞核是否完整，核膜是否光滑，细胞悬液中是否含有大量的碎片。
3. 在抽核过程中一定要在lysis buffer，wash buffer，resuspension buffer中加入RNase inhibitor，防止RNA在抽核过程中降解。
4. 所有实验操作一定要在冰上完成，实验器材要提前预冷。
单细胞核悬液质检
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质检要求： | |
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细胞活性 |
< 5% |
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细胞核浓度 |
700 -1200 cell/µl （仅做3 '端转录组细胞核浓度要求） |
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细胞核数目 |
10万 |
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结团率 |
< 5% |
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细胞核直径范围 |
< 10 µm |
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细胞核状态 |
细胞核完整、无褶皱、无破碎等 |
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核内RNA |
完整性良好，无降解 |
在高倍镜下观察，A中细胞核完整，有良好的边缘轮廓，质量最好；B有少量起泡迹象；C、D都有破损，不建议进行后续实验
结果展示
针对一些特别难抽核的组织样本（特别是脑组织），我们在原有的提取方法上研发出一套高质量高效提取细胞核的方法，下面展示获得的结果。可以看到，实验得到的单个神经细胞核完整无破裂，背景干净，结团率低，质检结果好，并且在多次实验中表现稳定，提高了后续单细胞多组学分析的成功率与可靠性。
脑组织抽核
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