2020年1月，新冠病毒基因组测序工作开启了一场疫苗研发竞赛。当时，乐观估计等到研究结果出炉起码还有好几年时间。例如：同样是冠状病毒的中东呼吸综合征病毒 (Middle East Respiratory Syndrome, MERS) 和严重急性呼吸综合征病毒 (Severe Acute Respiratory Syndrome, SARS) 疫苗花费了约2年时间才完成临床前研究，至今仍未获批。另外，流行性腮腺炎疫苗是当时开发最快的疫苗，从成型到获批花费了4年时间。而与之形成鲜明对比的是：Moderna和Pfizer/BioNTech的新冠疫苗仅花了11个月就获批。其中8个月是临床试验。“闪电”般的开发速度预计与以下三个因素密不可分：在这之前几十年前的基础研究、巨额的投资和科学家、公司开发及管理人员、医务人员、政府监管人员夜以继日的付出和汗合作。下面我们就来详细了解一下mRNA疫苗。
mRNA结构和功能
有机生命体中重要的组成部分可以说是双链DNA分子的结构。DNA单链中的每个单体 - 也就是每个核苷酸 - 由两部分组成：一个是连着一个磷酸基团的糖 (脱氧核糖)和一个碱基，这个碱基可以是腺嘌呤 (adenine, A)、鸟嘌呤 (guanine, G)、胞嘧啶 (cytosine, C) 或胸腺嘧啶 (thymine, T)。根据碱基互补的规则，A与T结合，C与G结合。DNA是遗传信息存储库，而以模板为基础的半保留复制是这种信息在所有有机生命中遗传信息得到复制并得到保留的方式。
当然， 为了实现其信息承载的功能，DNA必须做的不仅仅是复制。它还必须“表达”自己的信息。DNA中核苷酸的序列规定了蛋白质中氨基酸的顺序，但这并不一定意味着DNA本身指导蛋白质的合成。因为DNA位于真核细胞的细胞核中，而蛋白质的合成则发生在细胞质中。 因此，需要一些其他的分子将遗传信息从DNA传递到蛋白质合成位点 (核糖体)。RNA似乎扮演着这样一种“中间人”的角色，因为它与DNA的结构相似，这表明RNA可由DNA模板合成。当细胞需要一种特定的蛋白质时，相应染色体中极长的DNA分子的特定部分的核苷酸序列首先被复制成RNA (这一过程称为“转录”，transcription)。正是这些DNA片段转录的RNA，可作为模板指导蛋白质的合成 (这一过程称为“翻译”，translation)。 因此，细胞中信息的流动是：DNA → RNA → 蛋白质。所有细胞，从细菌到人类，都以这种方式表达它们的信息 - 这是一个现代分子生物学中最基本也是最重要的原则，称为中心法则。
那么，什么是RNA? 和DNA一样，RNA是由四种不同类型的核苷酸通过磷酸二酯键连接而成的线性聚合物。它在化学上与DNA有两个主要不同点：(1) RNA中糖的组成成分是核糖而不是脱氧核糖；(2) 尽管和DNA一样，RNA也含有腺嘌呤 (A)、鸟嘌呤 (G) 和胞嘧啶 (C)，但RNA最后一个碱基是尿嘧啶 (U) 而不是胸腺嘧啶 (T)。然而，糖和嘧啶的改变均不会改变碱基配对 (A与U结合，C与G结合)，因此DNA模板可以很容易地引导RNA的合成。
由于这种RNA在遗传信息传递中扮演的“中间人”的角色，充当蛋白质合成模板的RNA分子被称为messenger RNA (mRNA)。它们被一种酶(RNA聚合酶)转录，这种酶能催化DNA模板合成RNA。(RNA还有其他多种其他种类和功能，例如核糖体RNA：Ribosomal RNA，rRNA；作为连接分子，使氨基酸沿着mRNA模板排列连接：transfer RNAs，tRNAs；等等，在这里不做详述)
mRNA疫苗结构和各结构功能
mRNA疫苗由合成的mRNA分子组成，由此产生的抗原激发免疫反应。这种体外转录的mRNA分子模拟内源性mRNA的结构，有5个部分。从5ʹ端到3ʹ端分别是：5ʹ端帽状结构，5ʹ端非翻译区 (untranslated region, UTR)，一个编码抗原的开放阅读框，3ʹ端非翻译区和3ʹ端poly (A) 尾状结构。
另一种mRNA疫苗，被称为自我扩增的mRNA (self-amplifying mRNA)，除了上述提到的结构，同时还包含复制酶基因，该基因编码一种依赖于RNA的RNA聚合酶，这种从病毒衍生的聚合酶在细胞内扩增mRNA，使得较少的mRNA疫苗剂量即可表达大量免疫抗原。
接下来，我们就详细介绍一下这5个部分的细节：
5ʹ端帽状结构：5'端帽状结构像真核生物的mRNA一样，含一个7-甲基鸟苷，通过三磷酸桥接到mRNA的5'端。在哺乳动物中，从5 '端开始的第一个或第二个核苷酸在核糖的2 '羟基上被甲基化，这阻止了细胞质内的细胞器将其识别为病毒RNA，从而避免了相应免疫反应的发生。另外，5 '帽状结构保护mRNA的不被核酸外切酶降解。最后，5 '端帽状结构与3 '端poly(A) 尾状结构、poly(A) 结合蛋白以及真核细胞翻译起始因子4E (eukaryotic initiation factor 4E, eIF4E) 协同工作，使mRNA变成环状，并招募核糖体以启动蛋白质翻译。
5ʹ端和3’端非翻译区 (untranslated region, UTR)：编码区，也就是“编码抗原的开放阅读框”旁边的5 '端和3 ' 端UTR的作用是调节mRNA的翻译、半衰期以及其在细胞中的定位。人体中原本存在高表达基因中自然产生的UTR，如α-和β-珠蛋白基因，是合成mRNAs中UTR的首选。然而，由于UTR功能可能因为细胞类型不同而不同，因此根据靶细胞的不同，UTR的序列可做调整和优化。这些调整和优化的UTR序列通过排除微小RNA (microRNAs, miRNAs) 的结合位点和3 ' 端UTR含有丰富核苷酸AU的区域，以减少mRNA的降解。另外，调整和优化还包括UTR中某些特定的区域，这些区域的作用是阻止核糖体扫描mRNA。例如5 ' 端UTR中具有二级和三级结构的序列。
一个编码抗原的开放阅读框：编码抗原的开放阅读框是mRNA中最关键的组成部分，因为它包含了翻译成蛋白质的编码序列。尽管开放阅读框的可塑性不及非编码区，但它可以通过将人体内很少使用的密码子替换为经常出现的密码子来进行优化，当然编码蛋白的氨基酸序列是不会改变的。这样优化可增加蛋白质翻译。例如， CureVac (一家致力于mRNA创新的德国生物技术公司) 发现人类mRNA密码子中很少有A或U出现在第三个核苷酸的位置。CureVac创新的研究可使开放阅读框的密码子的第三个核苷酸中A或U被C或G 所替代。CureVac的针对新冠病毒的候选疫苗，CVnCoV，即采用了这种优化策略。虽然替换密码子中罕见的核苷酸是一种有吸引力的优化策略，但必须谨慎使用。因为针对某些蛋白质的翻译，较慢的罕见密码子翻译速率是蛋白质折叠所必需。
另外，为了最大化蛋白质的翻译，mRNA序列通常包含核苷的修饰，如假尿嘧啶、N1 - 甲基假尿嘧啶或其他核苷类似物。由于所有mRNA都包含核苷的修饰，免疫系统已经可以识别未修饰的单链RNA，这是病毒感染的一个标志。具体来说，未修饰的mRNA可被模式识别受体 (pattern recognition receptor, PRR) 所识别，如Toll样受体-3 (Toll-like receptors , TLR3)、TLR7、TLR8以及维甲酸诱导基因I (retinoic acid-inducible gene I, RIGI) 受体。TLR7和TLR8受体结合到mRNA序列中富含G或U的区域，触发I型干扰素的产生，如IFN-α，IFN-α阻断mRNA的翻译。核苷的修饰，特别是尿嘧啶的修饰，阻止了PRR的识别，使足够水平的蛋白质翻译产生足够的“疫苗”。Moderna和Pfizer/BioNTech新冠疫苗均含有核苷的修饰。另一种避免PRR识别的策略，由CureVac创新研究，使用基因工程的方法使密码子优化，通过提高疫苗中GC含量来减少U。
3ʹ端poly (A) 尾状结构：3ʹ端poly (A) 尾状结构的长度调控mRNA的翻译和半衰期。3ʹ端poly (A) 尾状结构与poly (A) 结合蛋白质相互作用，形成复合物，启动翻译并保护5ʹ端帽状结构不被酶降解。所以，一个足够长的尾状结构 (100-150bp) 是必须的。
由于新冠病毒的大流行，mRNA疫苗在过去的2020-2021年大放异彩。可能的优势包含1、mRNA疫苗仅传递到细胞质，不进入细胞核，不像DNA疫苗需整合到宿主的基因组；由此规避了基因组整合的风险，例如插入突变等。2、mRNA疫苗可在无细胞环境中通过体外转录 (In vitro transcribed, IVT) 产生，从而避免了使用微生物或培养的细胞来生产，从而避免了生产中相关的质量和安全问题。同时也使下游纯化流程技术更简便、生产成本更低。
这是我们关于mRNA系统介绍的第1篇文章 (基本结构)；后续我们还会详细介绍mRNA疫苗作用机制、mRNA疫苗的运载 (drug delivery)、生产流程、临床适应症及应用探索、临床试验进展、商业化进展、目前急需解决的问题等等。
Source:
1.Molecular Biology of the Cell (sixth edition)
2.The Cell: A Molecular Approach (eighth edition)
3.Namit Chaudhary et al. mRNA vaccines for infectious diseases: principles, delivery and clinical translation
4.Abishek Wadhwa et al. Opportunities and Challenges in the Delivery of mRNA-Based Vaccines
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