【实验目的】
（1）学习分离纯化噬菌体的基本原理和方法。
（2）掌握噬菌体效价测定的方法。
【实验原理】
噬菌体是一类专性寄生于原核细胞内的病毒。自然界中凡是有细菌和放线菌分布的地方，总可分离获得相应特异性的噬菌体。例如，粪便与阴沟污水中含有大量的大肠杆菌噬菌体；乳牛场有较多的乳酸杆菌，容易获得乳酸杆菌噬菌体。样品中加入敏感菌株与液体培养基混合后培养，噬菌体便能大量增殖、释放，从而可分离到特定的噬菌体。图14-1是常见的噬菌体类型。
图14-1 噬菌体（引自M．T．马迪根）a．噬菌体主要类型模式图；b．E．coli噬菌体T4电子显微镜照片
噬菌体的效价是指每毫升样品中所含具有感染性噬菌体的粒子数。噬菌体个体极其微小，专营细胞内寄生生活，用常规的微生物计数法无法测得其数量。由于噬菌体对其宿主细胞的裂解，在含有敏感菌株的平板上会出现肉眼可见的噬菌斑，一般一个噬菌体粒子形成一个噬菌斑，因此可根据一定体积样品所形成的噬菌斑数计算出噬菌体的效价。但是，样品中可能会有少数活噬菌体未能引起侵染，使噬菌斑计数结果往往比实际活噬菌体数偏低。因此，噬菌体的效价一般不用噬菌体粒子的绝对数量表示，而是采用噬菌斑形成单位（plaque-forming unit, PFU）表示。本实验是从阴沟污水中取样和分离大肠杆菌噬菌体，并用双层平板法测定其效价。
【实验器材】
1．实验材料大肠杆菌斜面、含有噬菌体的阴沟污水样品。
2．培养基上层牛肉膏蛋白胨琼脂培养基（含琼脂0.6％分装试管4mL）、底层牛肉膏蛋白胨琼脂培养基（含琼脂1.5％～2％）、牛肉膏蛋白胨水，培养基、三倍浓缩牛肉膏蛋白胨水培养基。
3．仪器和用具无菌吸管、无菌平皿、无菌抽滤瓶、三角涂棒、锥形瓶、恒温水浴锅、细菌过滤器等。
【实验步骤】
1．噬菌体的分离
（1）制备菌悬液：取大肠杆菌斜面（于37℃培养18～24h）1支，加4mL无菌水洗下菌苔，制成菌悬液。
（2）增殖噬菌体：取污水样2mL，置于三角烧瓶内，加入100mL三倍浓缩牛肉膏蛋白胨水培养基及2mL大肠杆菌菌液，于37℃振荡培养12～24h。注意：最好选取天然污水，如河水等。
（3）制备噬菌体裂解液：将上述培养液离心（2500r/min）15min，所得上清液用细菌过滤器过滤。取少量过滤液接入牛肉膏蛋白胨水培养基中，37℃培养过夜，以做无菌检查。若无细菌生长，表明菌已除尽。注意：过滤除菌时一定要做到无菌操作。
（4）噬菌体的检测：于牛肉膏蛋白胨琼脂培养基平板上滴加大肠杆菌菌悬液一滴，用无菌涂棒涂布成一薄层。待平板上菌液干后，滴加上述滤液数小滴于平板面上，将平板置于37℃培养过夜。如滤液内有大肠杆菌噬菌体存在，加滤液处便出现无菌生长的蚕食状透明斑。
2．噬菌体的纯化和增殖
（1）噬菌体样品的稀释：将已证明含有噬菌体的滤液用牛肉膏蛋白胨水培养基按10倍稀释法稀释成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5稀释度。
（2）倒底层平板：取直径9cm的平皿5只，每皿倒入约10mL底层琼脂培养基，依次标明10-1、10-2、10-3、10-4和10-5。
（3）制备上层混合液：取5支试管，依次标明10-1、10-2、10-3、10-4和10-5分别向每支试管中加入0.2mL对数期的大肠杆菌菌液，并对号加入0.1mL各稀释度的噬，菌体滤液，摇匀，37℃保温5min。
（4）倒上层平板：将制备好的上层混合液分别加到含4mL50℃保温的上层琼脂培养基试管中，充分摇匀，然后对号倒入底层琼脂已凝固的平板上，待上层琼脂凝固后，置于37℃培养18～24h。注意：上层培养基琼脂的浓度（0.6％）十分重要，过高或过低对形成噬菌斑均有较大的影响。
（5）噬菌体的纯化：在噬菌斑分布较分散的平板上，用接种针挑取典型（圆形）的噬菌斑，接种于含有大肠杆菌的牛肉膏蛋白胨水培养基中，37℃培养18～24h，再依上述方法进行分离纯化，直到平板上出现的噬菌斑的形态、大小完全一致（图14-2）。
图14-2 噬菌体效价测定（引自M．T．马迪根）a．双层平板法操作步骤；b．噬菌斑
（6）噬菌体增殖：将纯化的噬菌体裂解液按约1∶4的比例加入对数期大肠杆菌菌液中，37℃振荡培养24～48h，使噬菌体增殖。如此重复数次，可得到高效价的噬菌体。
3．噬菌体效价的测定
（1）敏感菌活化：将大肠杆菌接入装有20mL牛肉膏蛋白胨水培养基的锥形瓶中，30℃振荡培养12～16h。
（2）倒底层培养基：将底层培养基融化后按每皿10mL倒底层平板，共12个，分别标记10-7、10-8、10-9和对照，每种各3皿。
（3）噬菌体稀释：取0.5mL噬菌体浓缩液（增殖液），加到含4.5mL牛肉膏蛋白胨水培养基的试管中进行10倍系列稀释，依次稀释到10-9稀释度。
（4）噬菌体与菌液混合：取12支无菌空试管分别标记为10-7、10-8、10-9和对照各3支。用无菌吸管分别取10-7、10-8、10-9稀释度噬菌体各0.1mL加入相应标记的无菌空试管内（每个稀释度3个重复），在对照管中加入0.1mL无菌水。然后在上述各试管中分别加入0.2mL大肠杆菌菌液，震荡试管使之混合，于37℃水浴中保温5min。注意：噬菌体与细胞的比例。测定噬菌体效价应采用低感染复数，指示菌的细胞密度不宜过高，一般控制在1×107个/mL为宜。
（5）加上层培养基：取50℃保温的上层培养基5mL分别加入上述各试管中，立即旋摇混匀，再快速倒入相对应编号的底层培养基平板上，放在台面上摇匀，使上层培养基铺满平板，凝固后，于37℃培养24h。注意：倒上层培养基时速度要快。
（6）统计噬菌斑：仔细观察平板上形成的噬菌斑，记录结果。
【实验报告】
1．实验结果
（1）将各平板上的噬菌斑数记录于下表。
表14-1 平板上的噬菌斑数
（2）从上表中选取一组噬菌斑数在30～300个间的数值来计算噬菌体样品中的效价值。计算公式如下：
式中：N为效价值；Y为平均每皿噬菌斑数（PFU）；X为稀释度；V为取样量，单位为mL。例如，当稀释度为10-8时，取样量为0.1mL/皿，同一稀释度中3个平板上的噬菌斑的平均值为186个，则该样品的效价为：
2．思考题
（1）噬菌体效价的涵义是什么？有几种表示法？用哪一种方法测得效价更准确？为什么？
（2）要证实获得的噬菌体裂解液中确有噬菌体存在，除用本实验使用的双层平板法观察噬菌斑外，还可以用什么方法予以证实？
（3）试比较分离纯化噬菌体与分离纯化细菌在基本原理和具体方法上的异同。（陈宜涛）
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