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自Journal of agricultural and food chemistry上的“
Biochemical Characterization of a Novel Acidic Exochitinase from Rhizomucor miehei with Antifungal Activity”作者为中国农业大学食品科学与营养工程学院杨绍青等人。
几丁质酶(EC3.2.1.14)是一种几丁质水解酶，催化几丁质材料主干中β-1,4-糖苷键的裂解，是地球上第二丰富的生物量。由于几丁质酶具有其降解真菌细胞壁和昆虫外骨骼中甲壳素的独特能力，因此在不同的生物技术应用中获得了极大的兴趣，如n-乙酰甲壳寡糖的生产、几丁质废物转化为生物乙醇、真菌植物病原体的生物防治等。
作者克隆了米黑根霉的新几丁质酶基因(RmChi44)，并作为细胞内可溶性活性蛋白在大肠杆菌中表达。重组几丁质酶(RmChi44)经过同质纯化，并进行了生化表征。在SDS-PAGE上估计RmChi44的分子量为44.6kDa。RmChi44的酸性pH值为4.5，pH值在4.5−9.0内稳定。RmChi44的最佳温度为50°C。胶体几丁质和乙二醇几丁质的RmChi44的Km值分别为4.02mg/mL和1.55mg/mL。RmChi44水解胶体几丁质，主要生成n-乙酰基壳二糖，表现出外型裂解模式。此外，该酶显示β-N乙酰氨基葡萄糖酶活性，以聚合度(DP)2−5将N-乙酰COSs分裂成单体。此外，RmChi44对某些植物病原真菌具有抗真菌活性。这是第一个关于显示β-n-乙酰氨基葡萄糖酶活性和抗真菌活性的报道。
几丁质酶基因在大肠杆菌中的表达
为了在大肠杆菌中表达几丁质酶基因，采用引物RmChiF(5′ATCATGCCATGGCTCCATCATCGAACTCTACTACTGACAC3′)RmChiR(5′ATTCCGCTCGAGACATTTCGATGATTTTGTCGAGCCT-3′).进行PCR扩增cDNA的ORF区域将NcoI和XhoI位点分别添加到正向引物和反向引物中。PCR条件如下：94°C热启动5min，30个周期94°C30s，55°C30s，72°C1min，然后是一个周期72°C10min。纯化后的PCR产物经NcoI和XhoI酶切，亚克隆到pET-28a（ ）载体中，转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中进行蛋白表达。将转化子接种到含有卡那霉素的LB(50mg/mL)培养基中，以37°C，200rpm的转速孵育。培养液光密度(OD600)达到0.6−0.8后，加入异丙基β-D-硫代甘氨基苷(IPTG)，最终浓度为1mM，在30°C下培养12h。
重组几丁质酶的纯化
将粗酶应用于Ni−IDA柱(10×1cm)上，用缓冲液A(50mMTris-HClpH8.0，含20mM咪唑和500mM氯化钠)预平衡。未结合蛋白用缓冲液A洗涤，然后用缓冲液B(50mMTris-HClpH8.0，含50mM咪唑和500mM氯化钠)去除弱结合杂质。结合蛋白用缓冲液C(50mMTris-HClpH8.0，含200mM咪唑和500mM氯化钠)洗脱。所有的纯化过程均在4°C下进行，流速为1mL/min。收集几丁质酶活性高的洗脱组分。
纯化酶的天然分子质量通过在S-200HR柱(50×1cm)上进行凝胶过滤，用含有150mM氯化钠的50mM磷酸盐缓冲液(pH6.0)预平衡，流速为0.3mL/min。用于校准的分子质量标准中含有磷酸化酶b(97.2kDa)、胎牛血清中的胎蛋白（68.0kDa)、鸡蛋清中的白蛋白(45.0kDa)和糜蛋白酶原α(25.7kDa)。
几丁质酶的水解性质
将1%(w/v)底物在50mM柠檬酸缓冲液(pH4.5)和1U/mL几丁质酶在45°C下孵育8小时，分析纯化的几丁质酶对胶体几丁质和n-乙酰COSs(DP2−5)的水解性能。在不同时间间隔提取的等分液立即煮沸10min，然后进行薄层色谱分析。样品被发现在薄层色谱硅胶板上上，使用丁醇−乙酸−水中（2：1：1，v/v/v）溶剂系统，然后喷洒溶液I[12.5%（w/v）氢氧化钾乙醇和1%（v/v）乙酰丙酮1：20]，然后干燥，喷洒溶液II[3.33%（w/v）二甲基氨基苯甲醛乙醇−6：6：1（v/v/v）后，在烤箱中加热。
抗真菌活性测定
通过菌丝延伸抑制试验测定了纯化的几丁质酶的抗真菌活性。所选植物病原真菌为绿木霉(CGMCC3.3711)、黄霉(CGMCC3.3114)、灰赤霉(CGMCC3.3789)、尖孢镰刀菌(CGMCC3.2832)、茄镰刀菌(CGMCC3.3639)、炭疽菌。(CGMCC3.3484)和茄根核菌(CGMCC3.2888)分别在马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养皿(直径100mm)中心培养。当菌丝菌落发展到直径10−20毫米，不同数量的纯化几丁质酶(0、20和100μg醋酸缓冲液pH4.5)被发现在无菌纸盘（直径6毫米）距离5毫米远离菌丝菌落的边缘。然后将培养皿在30°C下进一步孵育，直到菌丝生长得到包含控制区的包膜圆盘。
酶的表达和纯化
从CAU432基因组DNA中克隆了几丁质酶基因(RmChi44)，并在大肠杆菌中表达。重组几丁质酶(RmChi44)的纯化具有明显的均匀性，纯化倍数为3.3倍，回收率为40.9%。通过SDS-PAGE和凝胶过滤，估计该纯化酶的分子量分别为44.6和44.7kDa，表明该酶是一种单体蛋白。
RmChi44的生化特性
RmChi44在pH值为4.5时最活跃，在pH4.5−9.0范围内保持稳定，在不同的缓冲液中处理30min后，其80%以上的活性被保留(图4B)。重组几丁质酶的最适温度为50°C(图4C)，并在达到50°C时保持稳定(图4D)。该酶在45、50、55和60°C下的热变性半衰期分别为1209、324、62和38min(图4E)。
ca2 （165.4%）和Ni2 （130.3%）显著提高了RmChi44的几丁质酶活性。相反，Hg2 （34.1%）、Sn2 （53.7%）和Ag （65.9%），并被Mg2 （86%）、Zn2 （84.7%）、Co2 （80.3%）、Cu2 （76.3%）和Mn2 （73.8%）显著抑制）。SDS、DTT、β-巯基乙醇等一些金属离子对酶活性无显著影响。
RmChi44的底物特异性和动力学参数
作者研究了RmChi44对不同底物的底物特异性（表2）。该酶对乙二醇几丁质（18.1U/mg）表现出最高的比活性，其次是胶质几丁质（11.9U/mg），对其他测试多糖的比活性较低，包括α-几丁质（0.2U/mg）、β-几丁质（0.1U/mg）、CMC（0.3U/mg）和壳聚糖（0.1U/mg）（表2）。在测试的N-乙酰COSs中，该酶对(GlcNAc)2（3.2U/mg）的比活性最高，其次是(GlcNAc)3（2.7U/mg）、GlcNAc4（1.9U/mg）和GlcNAc5（1.2U/mg）（表2）。此外，RmChi44对pNP-NAG也表现出相对较高的活性(3.6U/mg)。RmChi44对胶体几丁质和乙二醇几丁质的恒定动力学参数、Km和Vmax值分别为4.02mg/mL和12.7μmol/min/mg、1.55mg/mL和22.7μmol/min/mg（表3）。
RmChi44的水解性质
RmChi44水解胶体甲壳质，在初始水解阶段(0−15min)仅产生(GlcNAc)2，然后随着孵育时间的延长(15−480min)释放GlcNAc并积累(图5A)。为了检测(GlcNAc)2是否直接从胶壳质的非还原端释放，我们用HPLC法进一步分析了胶壳质水解早期(2、4、8、12min)的水解产物。结果显示，除(GlcNAc)2和微量的GlcNAc外，未检测到其他产物。在反应结束时，(GlcNAc)2和GlcNAc是主要的水解产物(图5A)。当使用N-乙酰COSs(DP2−5)作为底物时，RmChi44在反应结束时将底物完全转化为单体(GlcNAc)(图5B)，表明RmChi44具有β-N-乙酰氨基葡萄糖酶活性。
RmChi44的抗真菌活性
利用几种植物致病真菌培养皿评价RmChi44的抗真菌活性。RmChi44对炭疽菌、尖孢菌、茄僵菌和绿腐菌的生长有明显的抑制作用，在几丁质酶浸泡的纸盘周围有明显的抑制月形或区域。此外，抑制作用是剂量依赖性的。然而，即使在每盘100μg的浓度下，该酶对其他一些测试菌株，包括土孢杆菌、灰孢杆菌和茄兰也没有抗真菌活性。
综上所述，作者克隆了一种新型CAU432的几丁质酶(RmChi44)，并进行了生化表征。RmChi44是一个在SDS-PAGE上分子量为44.7kDa的单体。它在pH值为4.5和50°C时最为活跃。RmChi44主要通过外型裂解模式水解胶质甲壳素生成(GlcNAc)2。它显示了独特的β-N-乙酰氨基葡萄糖酶活性，将N-乙酰COSs转化为其单体。此外，该酶对几种被测试的病原真菌表现出较强的抗真菌活性。这些独特的特性可能使该酶在工业中具有巨大的潜力，特别是作为一种农业领域的生物防治剂。
整理：高放
DOI: 10.1021/acs.jafc.5b05127
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