文 / 利刃君
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高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography \ HPLC）是色谱法的一个重要分支，应用范围十分广泛，对样品的适用性广，不受分析对象挥发性和热稳定性的限制，几乎所有的化合物包括高沸点、极性、离子型化合物和大分子物质均可用高效液相色谱法分析测定，因而弥补了气相色谱法的不足。在目前已知的有机化合物中，可用气相色谱分析的约占20% ，而80%则需用高效液相色谱来分析。HPLC具有分离效能高、分析速度快、检测灵敏度好、能分析和分离高沸点且不能气化的热不稳定生理活性物质的特点，已成为化学、医学、工业、农学、商检和法检等学科领域中重要的分离分析技术应用。
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基本原理色谱法的分离原理是：溶于流动相(mobilephase)中的各组分经过固定相时，由于与固定相(stationphase)发生作用(吸附、分配、排阻、亲和)的大小、强弱不同，在固定相中滞留时间不同，从而先后从固定相中流出。又称为色层法、层析法。
高效液相色谱法以经典的液相色谱为基础，以液体为流动相，采用高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有颗粒极细的高效固定相的色谱柱，在柱内各成分被分离后，进入检测器进行检测，从而实现对试样的分析。
图1.高效液相色谱仪分析流程
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系统组成HPLC 系统一般由输液泵、进样器、色谱柱、检测器、数据记录及处理装置等组成。其中输液泵、色谱柱、检测器是关键部件。此外，还可根据需要配置梯度洗脱装置、在线脱气机、自动进样器、预柱或保护柱、柱温控制器等，现代HPLC 仪还有微机控制系统，进行自动化仪器控制和数据处理。制备型HPLC 仪还备有自动馏分收集装置。
图2.高效液相色谱仪的系统组成
1.输液系统输液泵是HPLC 系统中最重要的部件之一。输液泵按照输出液恒定的因素分为恒压泵和恒流泵，泵的性能好坏直接影响到整个系统的质量和分析结果的可靠性。
输液泵按工作方式分为气动泵和机械泵两大类。机械泵中又有螺旋传动注射泵、单活塞往复泵、双活塞往复泵和往复式隔膜泵。
表1.几种高压性能泵的性能比较
HPLC使用的输液泵应满足下列条件：
①流量稳定，其RSD 应＜0.5%，这对定性定量的准确性至关重要；
②流量范围宽，分析型应在0.1~10ml/min 范围内连续可调，制备型应能达到100 ml/min；③输出压力高，一般应能达到150~300kg/cm2；
④液缸容积小；
⑤密封性能好，耐腐蚀。
（1）往复式柱塞泵
活塞向外移动时，泵头出口单向阀关闭，同时流动相进入的入口单向阀打开，溶液（流动相）抽入活塞缸。当柱塞推入缸体时，入口单向阀关闭，出口单向阀打开，流动相被压出活塞缸，流向色谱柱。双活塞往复泵的输液流量比单活塞泵小得多。其优点是不必使用消除脉冲的阻尼器，避免了阻尼器的压力消耗，但缺点是设备成本较高，流量调节也比单活塞泵复杂。往复式柱塞泵的特点是不受整个色谱体系中其余部分阻力稍有变化的影响，连续供给恒定体积的流动相。
图3.单活塞往复式柱塞泵的构造（A）和双活塞往复式柱塞泵构造（a）及排液特性（b）
（2）隔膜型往复泵
隔膜型往复泵也是一种恒流泵，活塞与油接触，当活塞往复运动时，隔膜受到油压的作用，对流动相部分产生"吸引"或"推压"，使流动相部分的单向阀吸液或排液，从而获得稳定的液流。隔膜泵的活塞不直接与流动相接触，故不存在活塞密封垫磨损对流动相的污染。隔膜泵的死体积小（约0.1mL），因此，更换流动相后平衡快，有利于梯度洗脱。但隔膜泵结构比较复杂，价格较贵。
图4.隔膜型往复泵结构示意图
（3）气动放大泵
气动放大泵是一种恒压泵。泵头通常由两部分组成--单向阀和密封圈-柱塞杆。单向阀一般由阀体\塑料\或陶瓷阀座和红宝石球组成，在压力的作用下宝石球离开阀座，流动相流过单向阀；反之，在反向力的作用下，宝石球回到阀座上，此时流动相不再流过单向阀。
2.脱气装置流动相溶液往往因溶解有氧气或混入了空气而形成气泡。气泡进入检测器后会在色谱图上出现尖锐的噪音峰。小气泡慢慢聚集后会变成大气泡，大气泡进入流路或色谱柱中会使流动相的流速变慢或出现流速不稳定，致使基线起伏。气泡一旦进入色谱柱，排出这些气泡则很费时间。在荧光检测中,溶解氧还会使荧光淬灭。溶解气体还可能引起某些样品的氧化或使溶液pH值发生变化。
目前，液相色谱流动相脱气使用较多的是离线超声波振荡脱气、在线惰性气体鼓泡吹扫脱气和在线真空脱气。
超声波振荡脱气： 将配制好的流动相连容器放入超声水槽中脱气10-20min。这种方法比较简便，又基本上能满足日常分析操作的要求，所以，目前仍广泛采用。
惰性气体鼓泡吹扫脱气：将气源（钢瓶）中的气体（氦气）缓慢而均匀地通入储液罐中的流动相中，氦气分子将其它气体分子置换和顶替出去，而它本身在溶剂中的溶解度又很小，微量氦气所形成的小气泡对检测无影响。
真空脱气装置： 将流动相通过一段由多孔性合成树脂膜制造的输液管，该输液管外有真空容器，真空泵工作时，膜外侧被减压，分子量小的氧气、氮气、二氧化碳就会从膜内进入膜外而被脱除。
图5.真空在线脱气装置示意图
3.梯度洗脱装置HPLC 有等强度(isocratic)和梯度(gradient)洗脱两种方式。等度洗脱是在同一分析周期内流动相组成保持恒定，适合于组分数目较少，性质差别不大的样品。梯度洗脱是在一个分析周期内程序控制流动相的组成，如溶剂的极性、离子强度和pH 值等，用于分析组分数目多、性质差异较大的复杂样品。采用梯度洗脱可以缩短分析时间，提高分离度，改善峰形，提高检测灵敏度，但是常常引起基线漂移和降低重现性。两种溶剂组成的梯度洗脱可按任意程度混合，即有多种洗脱曲线：线性梯度、凹形梯度、凸形梯度和阶梯形梯度。线性梯度最常用，尤其适合于在反相柱上进行梯度洗脱。
- 线性梯度： 在某一段时间内连续而均匀增加流动相强度。
- 阶梯梯度： 直接从某一低强度的流动相改变为另一较高强度的流动相。
梯度洗脱有两种实现方式：低压梯度（外梯度）和高压梯度（内梯度）。
高压梯度一般只用于二元梯度，即用两个高压泵分别按设定的比例输送A和B两种流动相至混合器。具有精度高，易于实现自动化控制的优点。
图6.高压梯度装置结构示意图
低压梯度只需一个高压泵，与等度洗脱输液系统相比，就是在泵前安装了一个比例阀，混合就在比例阀中完成。在常压下混合往往容易形成气泡，所以低压梯度通常配置在线脱气装置。
图7.四元低压系统结构示意图
4.进样系统早期使用隔膜和停流进样器，装在色谱柱入口处。现在大都使用六通进样阀或自动进样器。进样装置要求：密封性好，死体积小，重复性好，保证中心进样，进样时对色谱系统的压力、流量影响小。
一般HPLC 分析常用六通进样阀，六通阀的进样方式有部分装液法和完全装液法两种。
①部分装液法进样：进样量应不大于定量环体积的50%（最多75％），并要求每次进样体积准确、相同。此法进样的准确度和重复性决定于注射器取样的熟练程度，而且易产生由进样引起的峰展宽。
②完全装液法进样：进样量应不小于定量环体积的5~10 倍（最少3倍），这样才能完全置换定量环内的流动相，消除管壁效应，确保进样的准确度及重复性。
图8.六通进样阀构造原理示意图
5.分离系统分离系统包括色谱柱、保护柱以及柱温箱。
色谱柱：色谱是一种分离分析手段，分离是核心，因此担负分离作用的色谱柱是色谱系统的心脏。色谱柱由柱管、压帽、卡套（密封环）、筛板（滤片）、接头、螺丝等组成。色谱填料为经过制备处理后，用于填充色谱柱的物质颗粒，通常是5-10粒径的球形颗粒。色谱柱按用途可分为分析型和制备型两类，尺寸规格也不同：
①常规分析柱（常量柱），内径2~5mm（常用4.6mm，国内有4mm 和5mm），柱长10~30cm；
②窄径柱（narrow bore，又称细管径柱、半微柱semi-microcolumn），内径1~2mm，柱长10~20cm；
③毛细管柱（又称微柱microcolumn），内径0.2~0.5mm；
④半制备柱，内径＞5mm；
⑤实验室制备柱，内径20~40mm，柱长10~30cm；
⑥生产制备柱：内径可达几十厘米。
图9.色谱柱结构示意图
保护柱：保护柱的作用主要是防止吸附性强的杂质对色谱柱污染，从而延长色谱柱的寿命。针对不同型号的色谱柱，应选择相对应填料的保护柱。应注意柱芯也是有寿命的，应该定期进行更换。
柱温箱：维持色谱柱温度的恒定，以免造成保留时间的变化，保证分离效果的稳定性。
6.检测器检测器是用来连续监测经色谱柱分离后的流出物的组成和含量变化的装置，是HPLC 仪的三大关键部件之一。HPLC的检测器要求灵敏度高、噪音低（即对温度、流量等外界变化不敏感）、线性范围宽、重复性好和适用范围广。
表2.HPLC常用检测器的基本特性
7.数据处理系统该系统可对测试数据进行采集、贮存、显示、打印和处理等操作，使样品的分离、制备或鉴定工作能正确开展。
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