当前蛋白质组学已成为21世纪生物医学、植物学、微生物学等研究领域最活跃的热点之一，其理论和方法在植物学科中的应用方兴未艾，已渗透到植物遗传学、植物生理学、植物发育生物学、植物生态学、植物共生生物学和植物病理学等诸多领域，为农学、林学、畜牧学和水产学等相关农业生物科学领域的研究注入了新的活力。在农业生产领域，蛋白质组学已经在作物遗传育种，作物逆境胁迫应答，作物品质改良和农作物-微生物相互作用等领域的研究中得到了广泛应用。
自然界中有多种非生物和生物因子都会对植物的生长发育造成不利影响，严重时甚至会导致植物的死亡。植物对这些逆境胁迫都有很强的响应机制，可通过一系列从细胞到生理水平的应答反应来适应这些不利的环境条件。应用蛋白质组学技术研究在逆境胁迫下植物蛋白质种类及表达量的变化，将有助于人们从整体和动态的蛋白质水平了解胁迫因子的伤害机制以及植物的适应机制。
英文标题：Integrated Analysis of Metabolome and Transcriptome Reveals Insights for Cold Tolerance in Rapeseed (Brassica napus L.)
中文标题：蛋白质组变化揭示了外源柠檬酸在减轻欧洲油菜铜毒性中的保护作用
研究对象：欧洲油菜幼苗
发表期刊：International Journal of MoleCular Sciences
运用技术：非标记定量蛋白质组学
研究背景
重金属污染正在迅速增加，给环境带来了许多严重的问题。过量的重金属不仅会降低土壤肥力和作物产量，还会通过食物链威胁人类健康。必需的微量营养素Cu在植物的广泛生物活动和氧化还原反应中发挥着至关重要的作用。然而，过量的铜会在植物中引起植物毒性，这可能会损害许多生理过程。柠檬酸（CA）是一种低分子量有机酸，作为三氯乙酸（TCA）循环的中间体发挥着重要作用，并提高了污染土壤中重金属的生物有效性和去除效率。CA 对金属诱导的氧化应激的保护作用也引起了科学家们的注意，以增加抗氧化防御系统中关键酶的活性。
甘蓝型油菜可以在枝条中积累大量的重金属，并且非常适合去除土壤中的重金属。此外，外源CA的应用促进了金属从根部到枝条的吸收和转运，从而促进了植物对包括铜在内的金属的摄取，并诱导了对氧化应激的耐受性。然而，欧洲油菜对铜胁迫以及与外源性CA结合的反应机制是未知的，尤其是在蛋白质水平上。本文使用LTQ Orbitrap质谱仪进行了非标记label-free定量蛋白质组学方法研究，以分析欧洲油菜幼苗中的铜响应差异丰度蛋白 (DAP)。
研究流程
研究结果
定量蛋白质的差异丰度曲线显示在热图中，以比较不同样品组之间的 DAP（图1）。差异蛋白质丰度通过指数修饰蛋白质丰度指数 (emPAI) 的归一化值的倍数变化比率显示为热图。与对照样品相比，在所有处理中检测到426种差异蛋白质，这些蛋白质基于它们的差异蛋白质丰度在热图中进行了显示说明（图1）。
图1 426种差异蛋白质的热图分析
使用LTQ Orbitrap质谱仪，在95%的置信水平下，在所有处理的叶子中共鉴定出6345种蛋白质。 在这6345种蛋白质中，在欧洲油菜的对照、 CA、Cu 25 μM、CA Cu 25 μM、Cu 50 μM 和CA Cu 50 μM处理的样品中分分别鉴定出1140、1086、1200、990、853 和 1076 种蛋白质，而在所有处理中通常鉴定出552种蛋白质。
在对照与CA比较中，共鉴定出211个DAP，包括13个上调蛋白和198个下调蛋白。在对照与Cu25 µM比较中，鉴定142个DAP，包括2个上调蛋白和 113个下调蛋白；在对照与CA Cu25 µM比较中，鉴定出131个 DAP，包括123个上调蛋白和8个下调蛋白；在对照与Cu 50 µM的比较中，鉴定出76个DAP，包括54个上调蛋白和22个下调蛋白；在对照与CA Cu 50 µM的比较中，鉴定出111个DAP，包括37个上调蛋白和74个下调蛋白（图2）。为了推断不同处理组中重叠和独特的蛋白质，分析了代表上调和下调蛋白质的DAP的维恩图。特别注意的是，在Cu25、CA Cu25、Cu 50和CA Cu50组中通常检测到7个上调的DAP，而在CA和Cu 25组之间共发现了105个下调的DAP。CA Cu 25样品中上调蛋白质 (98 DAP) 的数量越多，表明参与响应CA介导的铜胁迫的蛋白质数量越高。
图2 不同处理组DAPs的鉴定和统计学分析
DAVID功能注释分析表明，最富含GO的已鉴定蛋白质可以分配给各种功能 GO 术语（图3）。对于生物过程类别，大多数已鉴定的蛋白质分别参与翻译（131种蛋白质）、对金属离子的反应（114种蛋白质）和糖酵解（95种蛋白质）; 对于细胞成分类别，叶绿体（440种蛋白质）、细胞质（341种蛋白质）和细胞核（259种蛋白质）表现出主要的 GO 术语 。ATP结合（146种蛋白质）、核糖体的结构成分（128种蛋白质）和蛋白质结合（120种蛋白质）代表了分子功能类别中最丰富的组。GO 注释分析表明，这些最丰富的GO术语在植物对铜胁迫的反应中起着至关重要的作用。
图3 油菜各处理组所有鉴定到蛋白的GO注释
为了深入了解代谢变化，使用KEGG数据库（http://www.kegg.jp/；访问日期，2020年10月6日），并基于欧洲油菜幼苗叶片中铜胁迫改变的DAP构建了潜在的代谢途径。各样本组中最丰富的KEGG通路显示在图4。
图4油菜各处理组DAPs的KEGG代谢通路分析
研究结论
本文使用无标记蛋白质组方法，在差异处理的叶片中共鉴定出6345种蛋白质，其中426种蛋白质在处理组之间差异表达。基因本体（GO）和KEGG通路分析表明，大多数差异丰度蛋白质被发现参与能量和碳水化合物代谢、光合作用、蛋白质代谢、压力和防御、金属解毒和细胞壁重组。该研究结果表明，参与光合作用的叶绿素生物合成蛋白的下调与叶绿素含量的降低是一致的。这些发现为铜胁迫耐受性提供了潜在的分子机制，并开辟了一条通过外源应用CA加速植物处理铜的新途径。
参考文献
Ju YH, Roy SK, Roy Choudhury A, Kwon SJ, Choi JY, Rahman MA, Katsube-Tanaka T, Shiraiwa T, Lee MS, Cho K, Woo SH. Proteome Changes Reveal the Protective Roles of Exogenous Citric Acid in Alleviating Cu Toxicity in Brassica napus L. Int J Mol Sci. 2021 May 30;22(11):5879. doi: 10.3390/ijms22115879.
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