二十一、抑制差减杂交

是由Diatchenko等建立的以抑制性PCR和DNA差减杂交方法相结合的方法。

依据的主要技术有两点:(1)消减杂交;(2)抑制PCR。经抑制差减杂交后的cDNA群体不仅富集了差异表达基因(目的基因),而且目的基因间丰度的差异经过均等化作用已基本消除,使消减后的cDNA群体为丰度一致的目的基因群体。

抽提两种不同来源组织的mRNA(tester和driver),反转录成 cDNA,用4碱基识别酶(RsaI)或HaeIII酶切两种cDNA产生平端片段;将testerc DNA分成均等的两份,分别接上dapter1和adapter2两种接头,并与过量的经RsaI消化的driver样本变性后退火杂交。

第一次杂交后的4种产物:

a 单链testercDNA

b 自身退火的testercDNA双链

c tester和driver的异源双链

d drivercDNA

根据复性动力学原理,丰度高的单链cDNA退火时产生同源杂交速度快于丰度低的单链cDNA,因此第一次杂交使得丰度有差别的cDNA的单链分子的相对含量趋向一致。混合两份杂交样品,同时加入新的变性driver cDNA 进行第二次消减杂交。杂交完全后补平末端,加入合适引物(即adapter1和adapter2的部分特异序列)进行PCR扩增,只有含不同接头的双链DNA分子才可进行指数扩增,扩增产物即为目的片段。利用adapter上的酶切位点可进行克隆、测序等。

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二十二、蛋白质芯片

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二十三、Northern blot

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二十四、Southern blot

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二十五、荧光共振能量转移

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二十六、双分子荧光技术

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二十七、酶联免疫吸附测定(ELISA)

ELISA是一种免疫测定(immunoassay,IA)。

原理:抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。加入酶反应的底物后,底物被酶催化成为有色产物,产物的量与标本中受检物质的量直接相关,由此进行定性或定量分析。

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二十八、His-tag纯化蛋白

His•Tag序列(6、8或10个连续的组氨酸残基)与固定在基于NTA(氮川三乙酸镍) -和IDA- 的His•Bind树脂上的二价阳离子Ni2 结合。洗去未结合蛋白后,用咪唑或稍低的pH洗脱并回收目标蛋白。该通用系统使得可在温和、非变性条件,或存在6M胍或尿素条件下纯化蛋白。

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二十九、免疫组化

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三十、各种分子标记技术的比较

限制性片段长度多态性(Restriction fragment length polymorphisms ,RFLP) 可以作为遗传标记,开创了直接应用DNA多态性的新阶段,是最早应用的分子标记技术。

RFLP 是检测DNA 在限制性内切酶酶切后形成的特定DNA 片段的大小,反映DNA 分子上不同酶切位点的分布情况,因此DNA 序列上的微小变化,甚至1 个核苷酸的变化,也能引起限制性内切酶切点的丢失或产生, 导致酶切片段长度的变化。

随机扩增多态DNA (Randomamplified polymorphic DNA ,RAPD) 技术,由于其独特的检测DNA 多态性的方式使得RAPD技术很快渗透于基因研究的各个领域。RAPD 是建立于PCR 基础之上的分子标记技术。

基本原理:利用一个随机引物(8~10 个碱基) 通过PCR 反应非定点地扩增DNA 片段,然后用凝胶电泳分离扩增片段来进行DNA 多态性研究。对任一特定引物而言,它在基因组DNA 序列上有其特定的结合位点,一旦基因组在这些区域发生DNA 片段插入、缺失或碱基突变,就可能导致这些特定结合位点的分布发生变化,从而导致扩增产物的数量和大小发生改变,表现出多态性。

扩增片段长度多态技术(AFLP) ,又名限制片段选择扩增技术(Selective restriction fragment amplifi2cation ,SRFA) ,1993 年,荷兰KEYGENE 公司的Zabean 和Vos 等发明。AFLP 是近年来迅速发展起来的一种分子标记技术,它将基因组DNA 用成对的限制性内切酶双酶切后产生的片段用接头(与酶切位点互补) 连接起来,并通过5′端与接头互补的半特异性引物扩增得到大量DNA 片段,从而形成指纹图谱的分子标记技术。AFLP 指纹呈孟德尔式共显性和显隐性遗传。

SSR 也称微卫星DNA ,是一类由几个(多为2~6个) 碱基组成的基序串联重复而成的DNA 序列,其中最常见的是双核苷酸重复,即(CA) n和(TG) n ,每个微卫星DNA 的核心序列结构相同,重复单位数目10~60 个,其高度多态性主要来源于串联数目的不同。

不同遗传材料重复次数不同,导致了SSR 长度的高度变异性,这一变异性正是SSR 标记产生的基础。

单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism ,SNP) 被称为第3 代DNA 分子标记,是指同一位点的不同等位基因之间个别核苷酸的差异,这种差异包括单个碱基的缺失或插入,更常见的是单个核苷酸的替换,且常发生在嘌呤碱基(A 与G) 和嘧啶碱基(C 与T) 之间。SNP 标记可帮助区分两个个体遗传物质的差异,被认为是应用前景最好的遗传标记。

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