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*本文首发于“纳米酶Nanozymes”公众号，2020年9月26日
*编辑：俞纪元
引言
大家好，今天与大家分享两篇文章，涉及内容是纳米氧化铜的抗坏血酸氧化酶模拟酶活性，文章分别为2020年发表在ChemBioChem上的封面论文“Ascorbate oxidase mimetic activity of copper(II) oxide nanoparticles”与后续发表在Sensors and Actuators B: Chemical上的论文“One-pot cascade catalysis at neutral pH driven by CuO tandem nanozyme for ascorbic acid and alkaline phosphatase detection”，上述工作由福建医科大学药学院的陈伟教授课题组报道。
背景介绍
抗坏血酸氧化酶是一种含铜的酶，能够在有氧环境下催化抗坏血酸氧化生成脱氢抗坏血酸，并能与其它氧化还原反应相偶联起到末端氧化酶的作用，在生命体的物质代谢中扮演着重要的角色。然而，与众多天然酶相似，抗坏血酸氧化酶容易受到诸多因素的影响而失去生理活性，在实际应用中对其进行的相关实验操作条件较为苛刻，使其应用受到了极大的限制。自从具有过氧化物模拟酶活性的纳米酶被报道以来，越来越多的纳米酶被相继开发。纳米酶催化效率高，具备对酸、碱和热的稳定，又有经济、可回收等优点。但对于具有抗坏血酸氧化酶模拟酶活性的纳米材料仍有待充分研究，因此如何创造出具有抗坏血酸氧化酶模拟酶活性的纳米材料、探索其催化机制并应用于实际体系中是非常值得深入研究的课题。
自2011年陈伟教授课题组首次发现纳米氧化铜的模拟过氧化物酶活性以来，该课题组对纳米氧化铜模拟酶的催化特性以及在生命分析中的应用开展了系统的研究。首先，他们通过筛选比较，证明了商品化的纳米氧化铜（40 nm）在过氧化氢存在条件下，对经典过氧化物酶底物具有仿生催化能力。而后，通过可控制备技术获得了在水溶液中高度稳定的纳米氧化铜（6 nm），证明了粒径对其模拟过氧化物酶催化性能的影响作用，并分别构建了过氧化氢、葡萄糖、乳糖、胆固醇、尿素、脲酶等生物活性分子的测定方法。近年来，他们还发现纳米氧化铜具有优良的半胱氨酸氧化酶模拟酶活性，可在有氧条件下催化半胱氨酸氧化生成胱氨酸和过氧化氢。随后利用纳米氧化铜的双重模拟酶活性，该课题组成功设计了一种串联催化体系，并实现了对半胱氨酸的测定。相关研究成果相继发表于ChemCatChem（2011, 3, 1151-1154）、Analyst（2012, 137, 1706）、Talanta（2012, 99, 643-648）、Biosens. Bioelectron.（2013, 43, 1-5；2014, 61, 374–378；2017, 97, 21-25）、Anal. Method（2015, 7, 1924-1928）、Int. J. Environ. Sci. Technol.（2015, 12, 653-660）、Analyst（2017, 142, 3986-3992）。
图文解析 | Ascorbate oxidase mimetic activity of copper (II) oxide nanoparticles
图1 ChemBioChem封面论文 | 纳米氧化铜的抗坏血酸氧化酶模拟酶活性
论文“Ascorbate oxidase mimetic activity of copper(II) oxide nanoparticles”首次证明氧化铜纳米颗粒（CuO NPs）具有优秀的抗坏血酸氧化酶模拟酶活性，在有氧环境下，能够高效催化抗坏血酸（AA）氧化生成脱氢抗坏血酸（DHAA），进而与邻苯二胺（OPDA）特异性反应生成具有蓝色荧光的3-(1,2-二羟基乙基)呋喃[3,4- b]喹啉（DFQ）（图1）。透射电镜图谱（TEM）显示，CuO NPs的形态均匀，并且通过高斯分布拟合得到CuO NPs的平均粒径约为6.8 nm。XRD图谱证实了CuO NPs的成功合成（图2）。
图2 A) CuO NPs的TEM图；B) CuO NPs的粒径分布；C) CuO NPs的XRD图
为了证实CuO NPs的抗坏血酸氧化酶模拟酶活性，作者将AA与CuO NPs在O2存在的条件下进行反应。实验结果表明，与AA和AA/N2/ CuO NPs的紫外图谱相比，AA/O2/ CuO NPs组在265 nm处吸光值有明显下降，从而证实了AA的消耗。高效液相色谱的数据表明AA/O2/CuO NPs 在反应中生成了DHAA。此外，在CuO NPs存在下，AA能够迅速被O2氧化（~180 s），表明该反应是一个快速催化过程。实验进一步排除了CuO NPs中浸出的Cu2 对AA的作用。上述实验结果证明了CuO NPs具有抗坏血酸氧化酶模拟酶活性（图3）。通过酶促反应动力学拟合得出CuO NPs作为抗坏血酸氧化酶模拟酶对AA的米氏常数为0.1302 mM，该值与天然抗坏血酸氧化酶（0.0840 mM）相近，并且纳米氧化铜作为抗坏血酸氧化酶的稳定性明显强于天然抗坏血酸氧化酶，进一步证实CuO NPs的实用性。
图3 A) a：AA，b：AA/O2/CuO NPs，c：AA/N2/CuO NPs；B) a：AA，b：DHAA，c：AA/O2/CuO NPs的色谱图（265 nm），d：AA，e：DHAA, f：AA/O2/CuO NPs的色谱图（265 nm）；C) 在CuO NPs催化下AA被O2氧化后光谱随时间变化；D) 在CuO NPs（黑线）和Cu2 浸出液（红线）的催化下，AA在265 nm处吸光值随时间的变化
图4 A) OPDA/AA/O2/CuO NPs体系在不同AA浓度下的荧光发射光谱；B) AA检测的线性图谱；C) 该体系的选择性：1、半胱氨酸，2、同型半胱氨酸，3、谷胱甘肽，4、葡萄糖，5、乳糖，6、麦芽糖，7、果糖，8、柠檬酸，9、尿酸，10、AA（1-9：1.25 mM，10：0.125 mM）
OPDA本身是没有荧光的物质，但OPDA可以和DHAA发生特异性反应生成具有蓝色荧光的DFQ（激发波长为350 nm，发射波长为425 nm）。因此，利用CuO NPs的抗坏血酸氧化酶模拟酶活性结合OPDA与DHAA的反应过程可以构建一种新型的AA荧光分析方法。基于上述理论，本文检测了OPDA/AA/O2/CuO NPs体系在不同AA浓度下的荧光发射光谱，表明了在一定浓度范围内，AA浓度与反应体系荧光强度正相关。该检测方法的线性范围为1.25×10-6~1.125×10-4 M，最低检出限为3.2×10-8 M。相较于其它测定方法，该方法具有更宽的线性范围和更高的灵敏度。此外，该方法还具有良好的特异性，只有在AA存在的情况下才能产生高强度的荧光信号，在其它更高浓度的干扰物质存在条件下没有观察到明显的荧光信号（图4）。
这一研究成果作为封面论文发表在ChemBioChem上，福建医科大学的博士研究生何少斌和秦皇岛市第一医院的胡爱玲为论文共同第一作者，通讯作者为邓豪华副教授、厦门大学附属第一医院的洪国粦主任和陈伟教授，相关工作得到国家自然科学基金委的支持，并被ChemBioChem和EurJIC联合出品的“Inorganic Enzyme Mimics”专辑收录。
https://chemistry-europe.onlinelibrary.wiley.com/doi/toc/10.1002/(ISSN)1439-7633.Inorganic-Enzyme-Mimics
（相关链接：http://doi.org/10.1002/cbic.201900595）
图文解析 | One-pot cascade catalysis at neutral pH driven by CuO tandem nanozyme for ascorbic acid and alkaline phospHatase detection
继上述工作报道了CuO NPs的抗坏血酸氧化酶模拟酶活性，论文“One-pot cascade catalysis at neutral pH driven by CuO tandem nanozyme for ascorbic acid and alkaline phosphatase detection”报道了CuO NPs作为抗坏血酸氧化酶模拟酶催化AA氧化生成的产物中除了DHAA还有过氧化氢（H2O2），利用上述H2O2产物级联CuO NPs的过氧化物酶模拟酶活性催化氧化对苯二甲酸（TA）增强荧光应用于实际样品中AA与碱性磷酸酶的检测（图5）。该论文同时提出了CuO NPs作为多功能串联模拟酶的概念（CuO tandem nanozyme），能够在相似的环境条件下同时发挥其过氧化物酶模拟酶及抗坏血酸氧化酶模拟酶活性。目前将纳米酶的催化性能结合构建成一个类似于生物体内常见的有组织的酶联系统仍具一定的困难性和挑战性，因此CuO NPs作为新型多功能串联模拟酶有着巨大的潜力和优点，可能将有效地消除串联反应间因反应条件不同引起的不兼容性。
图5 CuO NPs作为抗坏血酸氧化酶模拟酶催化AA氧化生成H2O2偶联CuO NPs自身的过氧化物酶催化氧化TA增强荧光测定AA与碱性磷酸酶的方法
图6 A) CuO NPs的TEM图；B) CuO NPs的粒径分布；C) CuO NPs对TA-AA荧光体系的增敏作用，a：TA，b：TA CuO NPs，c：TA AA，d：TA AA CuO NPs；D) 过氧化氢酶对AA-TA-CuO NPs 荧光体系的影响，a：TA AA CuO NPs；b：TA AA CuO NPs 过氧化氢酶
该文所用的CuO NPs其制备方法与上述ChemBioChem文章相同（图6A/B），如图6C中所示，在没有AA存在时，TA体系无荧光产生；在没有CuO NPs存在时，由AA自氧化所产生的荧光非常微弱；而在CuO NPs和AA同时存在时，CuO NPs催化AA氧化生成H2O2并进一步催化H2O2氧化TA产生强烈的荧光。为进一步证实AA被CuO NPs催化氧化生成的产物中除了DHAA外还有H2O2，如图6D所示，在AA-TA-CuO NPs体系中加入过氧化氢酶，可使荧光产物的生成受到显著的抑制，说明在CuO NPs催化AA氧化的过程中有H2O2的生成。
在优化TA AA CuO NPs反应体系的过程中，作者发现CuO NPs作为多功能级联模拟酶（抗坏血酸氧化酶和过氧化物酶模拟酶活性）能够在相似的温度及pH值环境（45℃，pH = 7）下达到最佳的催化效率，该现象有利于CuO NPs用于构建自激活级联反应（图7）。
图7 A) 不同温度环境下，CuO NPs分别作为过氧化物酶或抗坏血酸氧化酶模拟酶的酶活性；B) 不同pH环境下，CuO NPs分别作为过氧化物酶或抗坏血酸氧化酶模拟酶的酶活性；C) TA-AA-CuO NPs的反应温度优化；D) TA-AA-CuO NPs的反应pH优化
基于CuO NPs作为多功能级联模拟酶催化AA氧化生成H2O2偶联其过氧化物酶催化氧化TA增强荧光的过程，作者提供了一种快速测定AA的荧光分析方法（激发波长为315 nm）。体系荧光强度与AA浓度在7.5×10-7-7.5×10-6 M和1.25×10-5-1.25×10-4 M呈线性关系，检测限为2.92×10-8 M（图8），具有良好的选择性。利用该方法测定药品以及橙汁中AA的含量，数值和中国药典中的碘-硫代硫酸钠反滴定法得到的数据一致，样品回收率为92.2~100.0%，相对标准偏差为0.5~1.9%。通过F检验和t检验，两种方法无显著差别（置信度为95%）。
图8 不同AA浓度下对应的TA-AA-CuO NPs体系产生的荧光发射光谱及线性图
图9 A) a：AAP-TA-CuO NPs, b：ALP-TA-CuO NPs, c：AAP-ALP-TA-CuO NPs及d：TA-AA-CuO NPs的荧光发射图谱；B) 抗坏血酸磷酸酯钠的反应浓度优化；C) 碱性磷酸酶线性图；D) 选择性实验，1-10：溶菌酶，肌酸氧化酶，葡萄糖氧化酶，过氧化氢酶，超氧化物歧化酶，胆碱氧化酶，蛋白酶K，辣根过氧化物酶，脲酶及碱性磷酸酶，上述浓度均为50 U/L
本文继而利用碱性磷酸酶可选择性水解抗坏血酸磷酸酯产生AA的过程，结合CuO NPs多功能串联模拟酶活性及TA-AA-CuO NPs体系，成功建立了检测碱性磷酸酶的传感器（图9）。碱性磷酸酶的线性检测范围为1.2-14.4 U/L，检测限为0.058 U/L。该方法具有重现性好、选择性好、成本低等优点。将所建立的方法成功应用到生物样品分析当中，血清样品的加标回收率实验结果较好。此外，作者进行了碱性磷酸酶抑制剂筛选实验，L-苯丙氨酸作为碱性磷酸酶抑制剂的半抑制浓度IC50为0.11 mM。
这一研究成果发表在Sensors and Actuators B: Chemical上，福建医科大学的博士研究生何少斌为论文第一作者，通讯作者为邓豪华副教授和陈伟教授，相关工作得到国家自然科学基金委的支持。
（相关链接：https://doi.org/10.1016/j.snb.2020.128511）
结论与展望
纳米氧化铜作为抗坏血酸氧化酶模拟酶及多功能酶的概念，不仅丰富了纳米酶的种类，也为研究纳米酶的催化机制提供了一个新的视角，拓展了纳米酶的应用范围。在后续的研究中，探索和设计具有更多模拟酶种类、更高选择性的纳米氧化铜，并合理地利用纳米氧化铜几种模拟酶性质（如过氧化物酶、半胱氨酸氧化酶或抗坏血酸氧化酶等）巧妙地应用于化工、食品、医学、环境等领域，是今后研究的重要方向。
参考文献：
[1] He, S. B., A. L. Hu, Q. Q. Zhuang, H. P. Peng, H. H. Deng, W. Chen G. L. Hong, Ascorbate Oxidase Mimetic Activity of Copper(II) Oxide Nanoparticles, ChemBioChem(2020) 1439-4227
[2] S.B. He, P. Balasubramanian, A.-L. Hu, X.-Q. Zheng, M.-T. Lin, M.-X. Xiao, H.-P. Peng, H.-H. Deng, W. Chen, One-pot cascade catalysis at neutral pH driven by CuO tandem nanozyme for ascorbic acid and alkaline phosphatase detection, Sens. Actuators, B(2020) 0925-4005.
撰稿：何少斌
校审：张益宏、马浩辰
编辑：徐庚辰
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