既要转录组测得了，又要细胞活得好
若干年前，有一个“诡异现象”困惑着攻读博士学位的陈万泽。他在诱导细胞死亡时经常发现，明明诱导条件和细胞来源相同，细胞死亡速度和反应却大不一样。这一“诡异现象”似乎说明：那些看起来一样的细胞其实不完全一样！
同样的问题困扰着所有研究单细胞的科学家。细胞从前世到今生的变化蕴含了我们生老病死的奥秘:一个受精卵的今时昨日就是一次个体发育的历程；一个癌细胞的来龙去脉就是一部肿瘤发病史；一个免疫细胞的出场谢幕就是一场和病原殊死搏杀的战争大戏。所以，跟踪细胞的动态变化过程不仅有助于解码细胞生命的奥秘，更有助于揭示疾病发生的根本原因。
细胞内各个基因是否表达、每个基因表达量的高低被称作细胞的转录组，可以很好地体现细胞的状态。2009年汤富酬教授开发了单细胞mRNA测序技术，可以了解单独一个细胞的转录组来解析细胞状态。
但是普通的单细胞转录组测序技术有一个局限：需要裂解杀死细胞获得所有mRNA才能做转录组测序。这就导致了科研人员只能解析某一时刻的单细胞转录组，无法在测量细胞转录组之后继续观察细胞的状态。以陈万泽遇到的问题为例：想知道看起来一样的细胞哪里不一样，最好的方法就是知道每个细胞在刺激前的转录组，再知道刺激后的细胞反应和刺激后的转录组。两相比较就知道了每个细胞的差异，以及哪些差异影响了细胞的反应。可是如果在刺激前就裂解细胞收集mRNA，那么细胞已经死亡无法接受刺激；如果在刺激完成后收集mRNA，则无法收集到刺激前的细胞转录组，从而陷入“既要确保细胞活着，又要完成测序”的死循环。
从韩家淮院士课题组博士毕业后，陈万泽老师来到了瑞士洛桑联邦理工学院（EPFL）Bart Deplancke课题组做博后，得到了诺贝尔奖得主Bruce Beutler（先天性免疫受体发现者诺贝尔奖得主）的指引：“一个问题很多人关心，就是一个好问题；一个好问题很多人试图解决都解决不了，就是一个难题。好问题值得去解决，而难题值得用你所有精力去努力”。
陈万泽决定，开发一种能对活细胞做转录组的技术，要能记录直径只有头发丝1/1000的细胞中转录组的“悲欢离合，电影人生”。
Live-seq开发难，步步逼近路回转
刚开始陈老师想收集细胞外泌体（细胞向外面吐出来的小泡，内含蛋白质、RNA等）做转录组测序，用外泌体的转录组来反映细胞的转录组。尽管进行了细胞改造、制备微流控芯片、大幅优化转录组测序流程等工作，但是由于细胞分泌的外泌体数量少得可怜，这个方法最后失败了。
左：外泌体示意图，修改自维基百科；右：捕获单细胞的微流控芯片
得益于EPFL学科交叉和非常频繁的学术交流，陈万泽了解到了材料领域常用但生命科学领域很小众的工具——原子力显微镜。这种显微镜有一个很尖很尖的硅探针，多用于检测物质表面性质。陈万泽将针尖修饰上polyT，用来结合mRNA的polyA尾巴，通过polyT和polyA的配对结合把mRNA“钓”出来。由于针尖很细，对细胞的损伤就很小。这样既“钓”到了细胞的mRNA，又保证了细胞能继续存活。经过尝试，这个方法能“钓”到基因，但是用了大量探针做实验只有2个探针有结果。虽然有进展，但高度受限于探针的昂贵和低成功率。
左：原子力显微镜原理图，修改自维基百科；右：探针修饰polyT示意图
俗话说得好，无巧不成书。一次学术交流中陈万泽和导师了解到，彼时隔壁瑞士联邦理工学院的Julia Vorholt实验室开发了一种特殊的原子力显微镜，能吸出来一部分细胞质……等会儿，你是说，他们实验室的原子力显微镜能吸出来一部分细胞质？
一番电话沟通，双方一拍即合。两个课题组优化了实验过程，包括探针中预混RNA酶抑制剂、低温下的快速操作、超微量样品转移、逐样品清洗避免交叉污染、图像下追踪细胞等措施来保证实验结果的可靠性，更巧的是陈万泽一开始为了外泌体测序优化的转录组测序流程此时也派上了用场。
经过不断努力这项新技术开发了出来，并最终被命名为——live-seq活细胞测序。
技术开发不随便，各个方面要检验
左图为实验示意图，右图为实拍显微镜吸取细胞质（论文作者供图）
技术开发出来必然要接受一系列的质问和考验：
普通单细胞转录组可以描述不同细胞状态，你live-seq能准确描述出不同细胞的类型和状态吗？
能！联合课题组用live-seq测了五种状态细胞的转录组，一共检测了294个细胞，平均每个细胞检测到约4112个基因的表达，与常规单细胞转录组方法检测到的基因数量接近。live-seq转录组的数据能够清晰地将五种细胞分开，说明live-seq测到的转录组能有效区分不同类型的细胞。
live-seq能有效区分不同的细胞（论文作者供图）
普通单细胞转录组可以描述整个细胞状态，你live-seq吸出来的这一部分能代表整个细胞吗？
能！课题组将live-seq测到的数据和整个细胞的转录组相比较，发现二者没有显著的区别，说明live-seq测到的数据能有效代表整个细胞的转录组。
live-seq和完整细胞的测序数据一致（论文作者供图）
开发live-seq是为了让细胞测序完还能存活的，你live-seq能保证细胞被吸取了一部分细胞质还存活吗？
能！live-seq平均每次吸取的细胞质只有1.1 pL，吸取后的细胞存活率在85%-89%，要知道细胞传代时胰蛋白酶解离后的细胞存活率也才90-95%。课题组还比较了不吸取细胞质的细胞、吸取细胞质后1小时的细胞、吸取4小时细胞的转录组，三者一致，说明live-seq没有对细胞造成很大的影响。并且在显微镜下，课题组能观察到吸取过细胞质后，细胞体积可以快速恢复到正常水平，还能正常分裂，更说明不影响细胞存活。
吸取细胞质不会对影响细胞转录组（论文作者供图）
live-seq之后细胞仍能正常生长、分裂（论文作者供图）
开发新技术是为了解决实际问题，你live-seq能解决实际问题吗？
能！而且立刻显现出不俗的实力。Live-seq能够先测量“过去”的细胞作为细胞变化的“因”，让细胞存活一段时间后，再对细胞进行测序作为细胞变化的“果”。能够同时呈现因果是Live-seq的重要特点。作为牛刀小试，联合课题组采用了RAW-G9巨噬细胞系模型，其中包含一条神奇的通路：当使用LPS刺激，细胞中的NF-κB表达量上升，NF-κB的上升会同时刺激Tnf-mCherry和NFKBIA的上升，但是NFKBIA的上升会抑制NF-κB。
LPS-NF-κB通路关系，红色箭头代表促进作用，蓝色线条代表抑制作用
使用传统的单细胞测序，只能暂停到细胞裂解的那个时刻，在这一时刻因为NF-κB的调控，Tnf-mCherry和NFKBIA要么同时高要么同时低；但是当使用live-seq观察的时候，NFKBIA表达量升高会导致Tnf-mCherry表达量下降，这是传统单细胞测序技术无论如何也观察不到的。这种奇妙的感觉就像Michael Jackson的“太空舞步”，暂停下来每一帧都好像在向前走，但是当你连贯起来看却发现人在后退！这一次live-seq完胜。
研究成果想要炫，学科交叉说了算
回顾live-seq的开发过程，学科交叉显得尤为重要，优化超微量RNA的测序步骤需要扎实的生物学实验功底，大批的数据分析需要生物信息的能力，更不要提原子力显微镜的使用需要跨到材料领域学习。这其中任何一项的缺失都会导致这项技术的开发失败，陈老师讲述中课题组之间的合作早就不是各自分工，而更像武侠小说里身负多项绝学后洗练招式的融会贯通。
学科交叉的魅力又不局限于本篇研究。现代科学在研究自然界的时候划分了很多学科，然而自然界原本就是一个相互联系的有机整体。科学交叉集分化与综合于一体，实现了科学的整体化。既是还原了自然本来面目，也是发现问题、解决问题的新战场，更有利于解决人类面临的复杂科学问题。
以上的研究经历和研究结果是2022年8月17日，中国科学院深圳先进技术研究院合成生物学研究所陈万泽课题组、瑞士洛桑联邦理工（EPFL）Bart Deplancke课题组和苏黎世联邦理工（ETHZ）Julia Vorholt课题组合作在Nature发表的题为Genome-wide molecular recording using Live-seq 的文章，该研究开创了一种利用原子力显微镜对活细胞转录组做测序的方法，可以将scRNA-seq从终点分析转换为时间分析来解决广泛的生物学问题。
论文链接：nature/articles/s41586-022-05046-9
DOI: 10.1038/s41586-022-05046-9
来源：中国科学院深圳先进技术研究院
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