细胞培养（cell culture）是指在体外模拟体内环境（无菌、适宜温度、酸碱度和一定营养条件等），使之生存、生长、繁殖并维持主要结构和功能的一种方法。细胞培养也叫细胞克隆技术，在生物学中的正规名词为细胞培养技术。
不论对于整个生物工程技术，还是其中之一的生物克隆技术来说，细胞培养都是一个必不可少的过程，细胞培养本身就是细胞的大规模克隆。细胞培养技术可以由一个细胞经过大量培养成为简单的单细胞或极少分化的多细胞，这是克隆技术必不可少的环节，而且细胞培养本身就是细胞的克隆。
细胞培养技术是细胞生物学研究方法中重要和常用技术，通过细胞培养既可以获得大量细胞，又可以借此研究细胞的信号转导、细胞的合成代谢、细胞的生长增殖等。
细胞培养总会遇到细胞污染、胞质疏松，状态不好，养不起来等等问题。今天小海星为大家盘点一下细胞培养中的一些常见问题。
01冷冻管应如何解冻？
取出冷冻管后，须立即放入37 °C水槽中快速解冻，轻摇冷冻管使其在1分钟内全部融化，并注意水面不可超过冷冻管盖沿，否则易发生污染情形。另冷冻管由液氮桶中取出解冻时，必须注意安全，预防冷冻管之爆裂。
注：操作时戴好手套，防止冻伤；带上防护眼镜可以防止液氮罐里刚刚拿出来的管子液氮爆炸……
复苏过程应快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重结晶。
冻存细胞从液氮中取出后，立即放入37℃水浴中，轻轻摇动冷冻管，使其在1 分钟内全部融化（不要超过3 分钟）。
解冻后的细胞可以直接接种到含有完全培养液的细胞培养瓶中直接进行培养，24小时后再用新鲜完全培养液替换旧培养液，以去除DMSO。
如果细胞对冷冻保护剂特别敏感，解冻后的细胞应先通过离心去除冷冻保护剂，然后再接种到含完全生长培养液的培养瓶中。
02细胞冷冻管解冻培养时，是否应马上去除DMSO？
除少数特别注明对DMSO敏感之细胞外，绝大部分细胞株（包括悬浮性细胞），在解冻之后，可直接放入10-15ml新鲜培养基，待隔天再置换新鲜培养基以去除DMSO即可，如此可避免大部分解冻后细胞无法生长或贴附之问题。
03细胞培养时能否更换培养基种类？
首先得确定现在用的培养基是否适合您的细胞生长。
细胞培养过程中，细胞增殖和形态正常的情况下最好不要更换培养基，细胞都有各自适应的培养基，更换培养条件，细胞可能无法快速适应，导致细胞死亡。
若必须更换，可尝试半换，让细胞逐渐适应新的培养基。
更换培养基的方法：
如果是贴壁生长的细胞， 一般可以直接把培养液吸掉， 再加入新的。加的时候注意不要对着长细胞的那一面。
如果是悬浮型的， 就需要低速离心 （把所有的细胞和培养液转移到离心管里， 或有些离心机配有直接离心细胞培养皿的装置）， 然后再吸掉上清液。加入新的培养液使细胞重新悬浮。
04细胞培养时能否更换胎牛血清？
首先要确定更换胎牛血清的理由，如果细胞培养无异常的话，不建议随意更换不同品牌和来源的胎牛血清。
血清是细胞培养上一个极为重要的营养来源，所以血清的来源（血源地）和品质对于细胞的生长会产生极大的影响。来自不同地域和等级的血清，在一些物质或分子的量或内容物上都有所不同，血清使用错误常会造成细胞死亡。
如果是使用的胎牛血清出现了问题，比如保存不当或操作不当导致血清成分析出、混浊、污染等情况，可以优先更换同品牌、等级、批次的血清。
如果是产品质量问题更换血清品牌的话，需要用一批细胞进行预实验才行，以保证细胞能够正常培养。
另外大家在购买胎牛血清的时候要选择正规来源，非正规来源的胎牛血清有很多安全隐患，对实验室、操作人员、细胞培养、实验数据都有很大的影响。
05培养细胞时应使用多少浓度的二氧化碳？
一般培养基中大都使用HCO3-/CO32-/H 作为pH的缓冲系统，而培养基中NaHCO3的含量将决定细胞培养时应使用的CO2浓度。当培养基中NaHCO3含量为每公升3.7 g时，细胞培养时应使用10%CO2；当培养基中NaHCO3为每公升1.5 g时，则应使用5% CO2培养细胞。
06一般在拿到细胞后，应该注意什么？
收到细胞后先不要开盖，放在培养箱静置若干小时后（看细胞密度而定）在倒置显微镜下观察细胞生长情况，并对细胞进行不同倍数拍照（建议对收细胞时的培养基拍一张照片，观察培养基的颜色和是否有漏液情况，显微镜下拍细胞100X，200X各一张），排除细胞本身污染的情况；收到细胞未开封，出现污染状况一般可以再申请免费发送一株细胞。
收到细胞时如无异常情况，请在显微镜下观察细胞密度，如为贴壁细胞，未超过80%汇合度时，将培养瓶中培养液吸出，留下10ml培养液继续培养；超过80%汇合度时，请按细胞培养条件传代培养。如为悬浮细胞，吸出培养液、1000转/分钟离心2分钟，吸出上清，管底细胞用新鲜培养基悬浮细胞后移回培养瓶。
细胞消化液建议使用PBS配制，慎用Hanks液配制。
07何时须更换培养基？
视细胞生长密度而定，或遵照细胞株基本数据上之更换时间，按时更换培养基即可。
08培养基中是否须添加抗生素？
除于特殊筛选系统中外，一般正常培养状态下，培养基中不应添加任何抗生素，但实际操作中有时会加入1%的青链霉素来避免细菌污染。
如果是没有进行过细胞培养的新手，对无菌技术没有信心的，或者提取的原代细胞，怕污染的，可以适量添加抗生素。
抗生素本身也是有毒性的，有些抗生素的药效浓度水平与毒效浓度水平非常接近，对细胞多少有伤害。
09贴壁细胞继代时该使用多少浓度的trypsin-EDTA？
一般使用浓度为0.05% trypsin-0.53mM EDTA·4Na。第一次开瓶后应立即少量分装于无菌试管中，保存于–20 °C，避免反复冷冻解冻造成trypsin之活性降低，并可减少污染之机会。
10悬浮细胞应如何继代处理？
一般仅需在原培养瓶中持续加入新鲜培养基，稀释细胞浓度即可，若培养液太多，可将培养瓶口端稍微抬高，直到无法容纳为止。分瓶时取出一部分含细胞的培养液至另一新的培养瓶，加入新鲜培养基稀释至适当浓度，重复前述步骤即可。
11一般动物细胞的离心速率应为多少转速？
欲回收动物细胞，其离心速率一般为300 g (约1,000 rpm)，5-10分钟，过高转速将造成细胞死亡。
12合适的细胞接种密度是多少？
依照细胞株基本数据上的接种密度或稀释分盘的比例接种即可。细胞数太少或稀释的太多亦可能会导致细胞生长过慢。
13细胞冷冻培养基的成份是哪些？
动物细胞冷冻保存时最常使用的冷冻培养基是含5-10% DMSO (dimethyl sulfoxide)和90-95 %原来细胞生长用的新鲜培养基均匀混合之。注意：由于DMSO稀释时会放出大量热能，故不可将DMSO直接加入细胞液中，必须使用前先行配制完成、且需提前放在4 °C预冷。
14L-谷氨酰胺在细胞培养中重要吗？
L-谷氨酰胺在细胞培养时是重要的。脱掉氨基后，L-谷氨酰胺可作为培养细胞的能量来源、参与蛋白质的合成和核酸代谢。L-谷氨酰胺在溶液中经过一段时间后会降解，但是确切的降解率一直没有最终定论。L-谷氨酰胺的降解导致氨的形成，而氨对于一些细胞具有毒性。
15DMSO的等级和无菌过滤方式？
冷冻保存使用的DMSO等级必须为Tissue culture grade，其本身即为无菌状况，第一次开瓶后应立即少量分装于无菌试管中，避光保存。若要过滤DMSO，则须使用耐DMSO的Nylon材质滤膜。
16细胞冻存的步骤是什么？
冻存方法一：冷冻管置于4 °C 30~60 分钟→ (-20 °C30 分钟*) → -80 °C 16~18 小时(或隔夜) → 液氮槽vaporphase 长期储存。
冻存方法二：冷冻管置于已设定程序的可程序降温机中每分钟降1-3 °C至–80 °C以下，再放入液氮槽vapor phase长期储存。*-20 °C 不可超过1 小时，以防止冰晶过大，造成细胞大量死亡，亦可跳过此步骤直接放入-80°C 冰箱中，但存活率会降低。
17冻存时细胞密度为多少比较合适？
冷冻管内细胞数目一般为1x106cells/ml vial，融合瘤细胞则以5x106cells/ml vial为宜。
18胰酶里EDTA的作用？
二价的离子会抑制胰酶活性，所以加入EDTA可以螯合掉Ca、Mg这样的二价离子。胰酶也要注意不要反复冻融哦！
19如何避免细胞培养过程中的污染？
主要还是考虑无菌环境，尽量做好操作台的灭菌，别把培养基滴落在生物安全柜的入风口，别在培养箱里把培养基打翻。这两个地方霉菌一旦滋生，那你就只能等着用甲醛熏蒸了。
紫外无法杀灭霉菌，酒精也不行，只能用甲醛熏蒸，但是一定要注意安全。复苏的时候，水浴锅也需要进行灭菌处理。一旦出现污染，不要急，能救的就用抗生素救一下，但是一般情况下，选择扔掉……
避免交叉感染，要不只能整个实验室消毒了。
20如果细胞发生微生物污染时，应如何处理？
直接灭菌后丢弃之。
21支原体污染会对细胞培养有何影响？
支原体污染几乎可影响细胞所有的生长参数。故进行实验前，必须确认细胞为mycoplasma-free，实验结果方有意义。
22侦测出细胞株有支原体污染时，该如何处理？
直接灭菌后丢弃是最好的方法，以避免污染其它细胞株。但如果样品比较珍贵，可以购买市面上现有的支原体去除试剂，尝试拯救一下。
23培养箱的水盘如何保持清洁？
定期更换无菌蒸馏水或无菌去离子水(至少每两周一次)。
24为何培养基保存于4 °C冰箱中，颜色会偏暗红色，且pH值会越来越偏碱性？
培养基保存在4 °C冰箱中， 培养基内的CO2会逐渐溢出，造成培养基越来越偏碱性。而培养基中的酸碱指示剂(通常为phenol red)的颜色也会随碱性增加而更偏暗红。
25培养基里的粉红色是什么？
酚红一般作为培养基中pH值的指标：当培养基呈中性时为红色，呈酸性时为黄色，碱性时为紫色。另外，酚红可以模拟类固醇激素（特别是雌激素）的作用。如果要避免类固醇反应，可以在无酚红的培养基里进行培养。
26各种细胞培养用的dish，flask是否均相同？
不同厂牌的dish或flask，其所coating的polymer不同，制造程序亦不同，但对大部分细胞没有太大之影响，只有少数细胞可能会因使用不同厂牌的dish或flask而表现出生长差异。
27购买的细胞冷冻管经解冻后，为何会发生细胞数目太少的情形？
研究人员在解冻细胞后出现细胞数目太少，大都是因为离心过程操作上的失误，造成细胞的物理性损伤，以及细胞流失。建议细胞解冻后不要立刻离心，待细胞生长隔夜后再更换培养基即可。
28购买的细胞出现死亡率高或状态不佳的可能原因？
研究人员在细胞培养时出现存活率不佳，常见原因可归纳为：培养基使用错误或培养基品质不佳。血清使用错误或血清的品质不佳。解冻过程错误。冷冻细胞解冻后，加以洗涤细胞和离心。悬浮细胞误认为死细胞。培养温度使用错误。细胞置于–80 °C太久。
海星生物对于细胞培养的各种问题都能轻松解决，望我们的分享能为您今后的实验带来帮助！
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