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*本文首发于“纳米酶Nanozymes”公众号，2022年9月12日
*编辑：俞纪元
过氧化氢酶(Catalase , CAT）是细胞抗氧化系统的重要组成部分，可以作为许多疾病或药物诱导毒性的生物标志物。所以，CAT活性的测定对于精确评估生物体的生理和病理条件以及合理高效地设计CAT纳米酶至关重要。近日，南京大学现代工程与应用科学学院的魏辉教授在Analytical Chemistry上发表了题为“A Dopamine-Enabled Universal Assay for Catalase and Catalase-Like Nanozymes”的研究工作，该文章第一作者为博士生林安琪。作者设计了一种基于多巴胺(Dopamine, DA)的通用检测方法，通过测定分解产生的氧的水平来测定CAT活性。DA作为敏感分子探针，在低氧条件或H2O2存在时，DA的自聚合受到抑制；而当存在CAT时，H2O2分解释放的O2促进了DA的聚合。在优化的条件下，作者实现了多种典型样品的CAT活性检测。
图1 基于DA的CAT分析方法的应用
首先，作者对天然CAT进行了一系列测试。如图2a所示，在富氧条件下，DA水溶液可以自发进行聚合反应，但过程较慢。而在乏氧环境下，DA聚合受到强烈抑制。此外，H2O2的存在使DA在有氧条件下的聚合也被抑制。如图2b所示，与乏氧条件相比，在有氧条件下培养30分钟后，DA在大约405 nm处出现了一个宽吸收峰，这源于着色产物聚多巴胺(PDA)，并且当检测系统中存在CAT时，在405 nm处观察到的吸光度(O.D.405 nm)更高，证实了该方法对CAT的可行性。如图2c所示，CAT和H2O2的存在导致了溶液颜色变深，且O.D.405 nm值较高。此外，如图2d所示， CAT的O.D.405 nm与其浓度(0.5~5U/ml范围内)呈线性关系。
图2 天然CAT的传感机制及检测方法。(a)乏氧环境下CAT增强DA自聚合示意图；(b)不同条件下DA聚合的紫外-可见光吸收光谱；(c) CAT的DA激活分析的定量条形图；(d) CAT浓度与O.D.405 nm的线性关系图
然后，作者选择了12种具有明显类CAT活性的纳米酶进行标准化比较。为了建立有效类CAT纳米酶的比较，定义了ΔO.D.405 nm，消除纳米酶类OXD活性的影响，如eq 1所示：
其中x1为O.D.405 nm (DA)，x2为O.D.405 nm (DA H2O2)，x3为O.D.405 nm (DA H2O2 样品)，x4为O.D.405 nm (DA 样品)。
如图3a所示，在相同的条件下，ΔO.D.405 nm有利于对不同的纳米酶进行客观和标准化的比较。此外，作者将A405 nm/A480 nm作为衡量指标，以确定纳米酶CAT/POD的选择性。如图3b所示，根据以下标准可以很好地对以上测试的各种纳米酶进行分类。基于上述结果，本检测方法不仅能检测类CAT纳米酶的活性，还能检测纳米酶对CAT/POD活性的选择性 (图3c)。
接下来，为了评估本方法在实际应用中的可行性，选取了不同动物组织进行测试。如图3d所示，O.D.405 nm的高低可以反映不同组织中CAT的含量，肝脏中CAT含量最高，肌肉中CAT含量最低。这一结果与文献报道一致。
此外，作者还收集了10名健康受试者在不同时段的非刺激唾液，计算了ΔO.D.405 nm，并将其总结为图3e所示的热图。ΔO.D.405 nm能反映唾液CAT活性，且随时间在合理范围内变化。
根据动物组织和人唾液的结果，本检测方法在不同类型的样品中具有通用性，适用于生物样本的离体分析(图3f)。
图3 对类CAT纳米酶，动物组织和人唾液中的CAT分析。(a)不同类CAT纳米酶的活性比较；(b)根据A405 nm/A480 nm值对不同材料进行分类；(c)体外分析示意图；(d)对ICR小鼠制备的不同组织匀浆进行试验；(e)对在不同时间收集的健康受试者唾液进行试验；(f)生物样本离体分析应用示意图。
与常用方法相比，本文提到的测试方法在灵敏度、特异性和通用性等方面具有较大优势，有助于制定CAT及类CAT纳米酶的测定标准。
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