哈喽，各位guys，大家早上好。大早上的你是不是和小编一样，在睡眼朦胧，昏昏欲睡呢？那就赶快和小编一起来篇文章提提神吧。今天小编想和大家分享的是一篇来自于nature biotechnology（IF=54.908）的综述文章，该工作对现有COVID-19相关单细胞组学数据进行整合分析，并汇总现有结论和研究成果，对单细胞免疫分析和COVID-19间关联进行整合。
自2019年底COVID-19被发现以来，当前全球累计确诊新冠肺炎病例已超3.7亿例，累计死亡病例超过560万病例，严重危害全球公众健康，对全球经济发展造成极大的冲击和破坏。2020年全球GDP下降4.9％，许多发展中国家的GDP甚至出现两位数的下降（我国除外）。此外，从长期来看，COVID-19对环境、社会和治理等方面的影响在一段时间内将持续存在。生产率增长的急剧下降，不平等程度的加剧，生物多样性的崩溃等，都是未来需要优先关注的重点。此外，尽管许多 COVID-19患者表现为无症状或仅出现轻度，中度症状，但有些患者仍会发展为严重疾病甚至死亡。另外，部分COVID-19痊愈者更是面临长期的后续健康问题，包括疲倦、呼吸急促、认知问题、嗅味觉失灵、肌肉无力和心悸等。
深入认识了解新冠肺炎发病机理，挖掘控制新冠流行的疾病机制对其诊疗与防控具有重要意义。多项研究表明免疫反应的改变是导致COVID-19患者出现严重症状的关键机制之一。因此，更好地了解与SARS-CoV-2保护性或病理性免疫相关的免疫细胞亚群和分子，有助于开发COVID-19的疫苗和治疗方法。单细胞技术，如流式细胞术、大规模细胞术、单细胞转录组学和单细胞多组学分析，为解剖单个细胞间免疫应答的异质性和揭示COVID-19发病机制的分子机制提供很大希望，在探究病毒感染及传播途径、加速临床中和抗体筛选等诸多方面助力新冠肺炎的防控。已经报道的单细胞免疫图谱研究已经确定与COVID-19疾病严重程度相关的固有和适应性免疫细胞亚群，以及与COVID-19疫苗和治疗方法开发潜在相关的免疫因子和免疫通路。然而，现阶段还没有较为综合的COVID-19相关单细胞组学分析数据库。为促进对SARS-CoV-2感染免疫学的整合研究和meta分析，研究者对21个已发布的单细胞测序数据集(超过320万个细胞)进行整合概况，提供标准化、可下载版本的数据，并构建一个可用于数据探索的交互式可视化网站，有助于帮助新冠的诊疗与防控。
废话不多说，快来和小编一起开启今天的学习旅程吧。
SARS-CoV-2感染的单细胞免疫学
1. 单细胞技术和相关数据集
迄今为止在COVID-19研究中使用的单细胞技术，如流式细胞术、大规模细胞术、单细胞转录组学等，其中包括62篇已发表的文章和两篇预印本文章对COVID-19背景下应用一项或多项单细胞技术的研究（表1）。本研究包括多个单细胞测序数据集，其研究的样本量和维度如图1所示。流式细胞术是最常用的单细胞技术，但scRNA-seq和单细胞多组学分析也得到更多的使用。流式或大规模细胞术对多达300个个体和多达62个标记物的一个或多个面板的数据进行研究;54个数据集中有25个包含纵向数据(图1a)。大多数单细胞测序研究分析来自少于150个人的50,000个细胞;其中只有少数包含纵向数据(图1b)研究者对64篇文章中通过单细胞技术获得的关键结论进行简要总结，包括新冠与先天免疫细胞、B细胞和T细胞之间的关系，以及单细胞数据与免疫保护之间的相关性进行总结。
表1. 单细胞技术在新冠肺炎研究中的应用
图1. 使用一项或多项单细胞技术发表的64篇COVID-19相关文章的特征展示
(2020年3月至2021年3月)
2. 先天免疫反应
大多数基于流式细胞术和大规模细胞术的COVID-19患者外周血单核细胞（PBMCs）分析称，与健康者相比，循环嗜碱性粒细胞单核细胞、树突状细胞(dc)和自然杀伤细胞(NK)的丰度降低，重症COVID-19患者的减少比轻度COVID-19患者的减少更多。相反，与健康献血者相比，COVID-19患者的循环中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和单核细胞髓源性抑制细胞的数量增加，COVID-19重症患者的数量比COVID-19轻症患者的数量增加更多。中性粒细胞与淋巴细胞的比值也被报道与重症COVID-19相关。
NK细胞：高维流式细胞术使免疫细胞亚群的深入表征成为可能。一份关于NK细胞的研究显示，与健康对照组相比，COVID-19患者的循环NK细胞较少，但高度激活和增殖的NK细胞更多。重症COVID-19与循环适应性NK细胞水平的增加有关，表明适应性和活化的NK细胞在COVID-19发病机制中起作用。scRNA-seq数据分析进一步表明在COVID-19中，NK细胞高度激活。
中性粒细胞：重症COVID-19中存在嗜中性粒细胞胞外陷阱。通过scRNA-seq和中性粒细胞颗粒相关基因的特征性表达以及典型中性粒细胞标志物的表达缺陷，研究者发现一个发展中的中性粒细胞亚群，该亚群在急性呼吸窘迫综合征患者中特异性增加。另一项以scRNA-seq、高维流式细胞术和大规模细胞术为基础的研究报告称，重症COVID-19与循环中未成熟中性粒细胞大量增加以及中性粒细胞簇的出现有关，中性粒细胞簇的特征是S100A8和S100A9等基因的上调。
树突细胞（DCs）：一份包含较大样本量（52名COVID-19患者，62名健康对照患者）的单细胞数据表明，COVID-19患者血浆细胞样DCs (pDCs)数量减少，这些pDCs中mTOR蛋白表达减少，提示COVID-19患者血浆细胞样DCs可能存在干扰素(IFN)-α信号缺失。
单核细胞：在另一项样本量也相对较大的数据中(53名COVID-19患者、8名流感样疾病患者和48名健康对照组)，研究人员使用单细胞转录组(scRNA-seq)和蛋白质组(CyTOF)分析测试不同的先天免疫反应是否与COVID-19的临床进展相关。研究显示，与健康对照组相比，轻度COVID-19患者炎症性HLA-DR-high-CD11c-high-CD14 单核细胞水平升高。相反,重症COVID-19患者不仅可以通过HLA-DR低表达的单核细胞群(提示单核细胞功能异常)和抗炎巨噬细胞功能相关基因表达增强来区分，还可以通过大量不成熟中性粒细胞表达免疫抑制或功能障碍标志物来区分。这些发现确定单核细胞反应的功能失调以及骨髓生成的异常是COVID-19进展的潜在重要过程。
通过单细胞技术进行的免疫细胞表型分析，对重症COVID-19与SARS-CoV-2感染相关的多系统炎症综合征(MIS-C)中可能失调的免疫途径有更深入的了解。这些了解反过来可以针对具有治疗潜力的免疫因素，为目前和未来的COVID-19抗炎治疗策略的发展提供信息。已有证据表明这种抗炎治疗策略可能有效。此外，流式细胞术、大规模细胞术和scRNA-seq检测均显示，在重症COVID-19患者以及与SARS-CoV-2感染相关的MIS-C儿童中，单核细胞HLA-DR和CD86表达降低意味着抗原向T细胞递呈过程可能受损。单核细胞HLA-DR的下调可能是由白细胞介素(IL)-6驱动的，在重症COVID-19患者和MIS-C儿童患者中，由于IL -6升高导致的HLA-DR表达降低，可以通过Tocilizumab(一种针对IL-6受体(IL-6R)并阻断IL-6信号的人源化免疫球蛋白(Ig)G1κ单克隆抗体)部分恢复。
Tocilizumab在预防中度COVID-19患者疾病进展，插管或死亡方面没有疗效；然而，后一项研究在疗效比较中有很大的置信区间，另一项报告表明，Tocilizumab在降低通气需求和死亡率方面有潜在益处。因此，IL-6R阻断剂是否能使中度或重度COVID-19患者受益的问题仍然悬而未决。其他趋化因子受体阻断剂也正在进行临床试验。基于COVID-19危重或非危重患者鼻咽样本的scRNA-seq测序，COVID-19中度或危重患者的鼻咽和支气管样本的scRNA-seq数据分析表明趋化因子受体CCR1也被识别为潜在的治疗靶点。
巨噬细胞：对气道和肺泡细胞的多项单细胞研究揭示巨噬细胞在COVID-19中的作用，特别是巨噬细胞反应失调可能导致病理性炎症。危重型COVID-19患者表现为上皮细胞和免疫细胞之间配体受体相互作用增加，非resident巨噬细胞中促炎趋化因子和细胞因子基因上调，中性粒细胞、巨噬细胞和CD8 T细胞中CCR1上调。以上发现表明，肺部免疫细胞招募周期(分化为炎性巨噬细胞的单核细胞，进一步招募和激活更多的免疫细胞)对重症COVID-19中观察到的上皮损伤的影响。对BALF细胞的scRNA-seq分析显示，支气管肺泡巨噬细胞的比例以及炎症细胞因子和趋化因子受体的水平与疾病的严重程度呈正相关。重症COVID-19的巨噬细胞还表现为FCN1和SPP1的高表达，提示肺泡巨噬细胞可能驱动重症COVID-19患者的局部炎症反应。最后，SARS-CoV-2感染引起的肺炎患者BALF细胞的流式细胞术和scRNA-seq数据显示，肺泡腔内存在高水平的单核细胞以及CD4 和CD8 T细胞。scRNA-seq在SARS-CoV-2感染引起的肺炎患者的T细胞中发现多个与组织驻留的肺泡巨噬细胞和单核细胞来源的肺泡巨噬细胞对应的簇，以及IFNG的表达。通过流式细胞术分类的肺泡巨噬细胞批量测序识别IFN反应特征，并在肺泡巨噬细胞中发现SARS-CoV-2 RNA，表明SARS-CoV-2可以在肺泡巨噬细胞中复制，这支持严重COVID-19时激活的T细胞释放IFN-γ的假说。反过来，这种IFN-γ驱动肺泡巨噬细胞中的IFN反应，导致单核细胞来源的肺泡巨噬细胞的招募，完成炎症信号循环。
另一项来自于四个健康的捐赠者,5名流感感染患者和名8 COVID-19患者PBMCs的RNA-seq分析表明，基于IFN-I相关转录特征和相关炎性转录特征可以区分重症患者的单核细胞。这一发现表明IFN-I反应有助于增加严重COVID-19的有害炎症的假设。
3. B细胞反应
中和抗体(nAbs)在预防SARS-CoV-2感染和COVID-19疾病中有着重要的作用，因此，人们对识别针对SARS-CoV-2的有效nAbs产生浓厚的兴趣。由于B细胞表现出广泛多变(V)、多样性(D)和连接(J)基因(VDJ)重组以及体细胞过度突变特征，因此这种分析需要单细胞方法完成。
免疫球蛋白序列：识别相关抗体序列的一般策略是通过scRNA-seq对COVID-19恢复期个体的抗原特异性记忆B细胞进行排序和加工。单细胞水平的VDJ测序(scVDJ-seq34)已识别出对SARS-CoV-2具有预防或治疗效果的nAb，为nAb临床试验提供有效帮助。
在一项采用高通量scRNA VDJ-seq的研究中，识别出约9000个RBD结合的B细胞克隆型，产生14个有效的单克隆抗体，其中一个在小鼠模型中被证明可以防止SARS-CoV-2感染。耦合的scRNA-seq数据允许识别原始B细胞和记忆B细胞的子集，并通过过滤出在原始B细胞和耗竭B细胞中富集的克隆型，帮助提高nAb的选择效率。另一项使用scRNA VDJ-seq的研究也鉴定出19个有效的单克隆抗体，包括RBD结合的和非RBD结合的单克隆抗体，其中一个在仓鼠模型中被证明可以预防SARS-CoV-2。单细胞功能分析与scVDJ-seq的联合应用，可以识别出对刺突糖蛋白具有不同反应性和与SARS-CoV-2具有交叉反应性的五类主要单克隆抗体。对来自稳定的COVID-19患者(住院并最终出院)和进展的COVID-19患者(在重症监护室(ICU)接受治疗并最终死亡)的PBMC来源单细胞数据的多维整合，包括scRNA-seq和CITE-seq，B细胞受体(BCR)和T细胞受体(TCR)测序等表明COVID-19中存在复杂的B细胞应答，包括高比例的未突变的Igγ重链(IGHG) B细胞克隆，与多个突变的B细胞克隆一起出现，随着时间的推移，体细胞过度突变水平似乎没有增加。后者可能是由于记忆B细胞与其他冠状病毒的交叉响应未能形成。
B细胞特征：高维流式细胞术已被用于表征和比较不同严重程度的COVID-19患者的B细胞反应。一个由24 marker组成的特征可用来识别B细胞群体，并评估其激活状态，从而可以识别滤泡外B细胞过度激活与COVID-19疾病严重程度之间的相关性。重症患者的RBD靶向SARS-CoV-2单克隆抗体在血清中浓度较高，也引发一个问题，即重症COVID-19患者的这种独特的B细胞反应是否无效，甚至可能具有致病性。其他研究已经描述体液免疫反应与疾病严重程度相关。然而，这些正相关性是否仅仅是因为初始病毒载量的增加，仍然是一个悬而未决的问题。不同研究报告具有直接、反向或无相关性等不同的结果。这一差异可能是由于取样位置，取样时间和种群的不同造成的。无论如何，需要进行更多的研究来发现感染个体保护性和非保护性体液反应的细胞和分子决定因素。
趋同抗体群(多个患者共享的vdj高度相似的抗体，通常只构成病毒特异性B细胞应答的一小部分)也已被确定，这表明大多数COVID-19患者对RBD具有趋同的Ig重链，这可能是由于接种RBD疫苗导致的。
B细胞表型：在一项研究中，研究人员利用RBD四聚体富集和流式细胞术对罕见的RBD特异性B细胞进行表型分析，对从轻度症状的COVID-19患者中恢复过来的纵向样本进行分析调查。症状出现后1 - 3个月，RBD特异性记忆B细胞数量增加，COVID-19样本中RBD特异性记忆B细胞数量显著高于健康对照组。此外，典型的记忆B细胞表型的数量也在症状出现后1 - 3个月增加，而Tbet-high记忆B细胞通常在慢性感染中发现，保持较低水平。另外，记忆B细胞可能有助于防止二次感染。
人类组织成像平台结合多色免疫荧光和定量自动扫描显微镜的多光谱成像，已被用于研究从COVID-19死亡患者尸体中获得的单细胞水平的胸椎淋巴结和脾脏。与需要分离组织的单细胞方法相比，这种方法的优点是可以在很大程度上保存组织结构，使研究细胞与细胞之间的相互作用成为可能。这些患者淋巴结中生发中心缺失，同时淋巴结和脾脏中中心B细胞和卵泡辅助T细胞数量显著减少。以上结果表明，在COVID-19患者(特别是重症COVID-19患者)中观察到的浆质体比例增加，与抗病毒体液免疫欠佳和疾病相关。
4. T细胞响应
使用流式细胞术检测COVID-19患者外周血单核细胞的多项研究表明T淋巴细胞减少。在covid -19相关的MIS-C患者中也观察到类似的T细胞淋巴细胞减少。虽然有报道称，COVID-19患者和流感患者CD4 和CD8 T细胞数量的减少具有相似性，但一些研究人员观察到，COVID-19患者CD4 T细胞数量的减少比流感患者更多。T细胞数量减少也与疾病严重程度有关，因为在COVID-19重症患者与中度或轻度患者，或ICU患者与非ICU患者中，CD4 和CD8 T细胞数量均显著减少。COVID-19患者中CD4 /CD8 T细胞比值提示SARS-CoV-2感染可能会优先影响CD8 T细胞。
T细胞表型：多参数流式细胞术还揭示COVID-19患者出现T细胞的表型和功能改变，主要包括COVID-19中T细胞的过度激活，其出现表达激活、增殖或耗竭标记物的亚群升高。与健康对照组相比，在COVID-19患者或重症患者中，活化的(HLA-DR CD38 、CD38 、HLA-DR 、CD25 CD4 和CD25 CD8 )、增殖的(Ki67 CD8 或Ki67 CD4 )和耗竭的(PD-1 CD8 或PD-1 CD4 、TIGIT 或NKG2A ) T细胞水平显著增加。急性COVID-19患者中大多数活化的CD8 T细胞已被证明对SARS-CoV-2具有特异性。然而，也有研究发现可能由于采样时间的差异，与健康对照组相比，流感患者和COVID-19患者中HLA-DR CD38 活化的CD8 T细胞丰度均发生降低。值得注意的是，对BALF样本中CD8 T细胞的scRNA-seq和单细胞TCR测序(scTCR-seq)分析发现组织resident记忆T细胞的特征，以及其与轻度疾病相关的克隆扩展水平增加有关，而增殖能力的提高与重症患者相关。对COVID-19和神经后遗症(neuro-covid)患者分离的脑脊液白细胞的scRNA-seq分析发现，与对照组患者相比，表达耗竭标记物的CD4 T细胞水平较高。
流式细胞术和scRNA-seq也发现COVID-19中T细胞分化和细胞毒性的改变。重症COVID-19患者中细胞毒性CD8 T细胞的比例高于健康对照组，且其细胞毒性分子表达增加。细胞毒性的增加已被认为有助于上皮损伤。此外，COVID-19患者外周血中枢记忆CD8 T细胞减少，衰老和效应记忆CD45RA CD8 T细胞增加，提示向终末分化倾斜。另一项研究中，在COVID-19患者的胸淋巴结和脾脏解剖组织中，CD4 BCL-6 生发中心型TFH细胞数量显著减少，同时滤泡中肿瘤坏死因子(TNF)-α水平升高，1型T辅助(TH1)细胞数量增加。这些结果表明，COVID-19损害TFH细胞的分化可能导致上述生发中心的缺失。
T细胞特异性：通过多种基于流式细胞术的技术，如细胞内细胞因子染色、激活诱导的标记物分析和主要组织相容性复合体(MHC)多聚体分析等，在急性COVID-19患者和恢复期患者中发现存在尖峰和非尖峰表位的SARS-CoV-2特异性T细胞，表明感染后会形成病毒特异性记忆T细胞。尽管重症COVID-19患者的SARS-CoV-2特异性T细胞响应总体上比轻症患者表现出更高的广度和量级，但轻症患者中SARS-CoV-2特异性CD8 T细胞的比例高于重症患者。SARS-CoV-2特异性CD4 T细胞主要是TH1细胞，主要表现为中枢记忆T细胞表型，而SARS-CoV-2特异性CD8 T细胞在效应记忆和终末分化效应亚群中更丰富。对SARS-CoV-2响应性CD4 T细胞的scRNA-seq和scTCR-seq分析显示， SARS-CoV-2特异性细胞毒性CD4 T细胞和细胞毒性TFH细胞增加与疾病严重程度之间存在关联，调节性T细胞与疾病严重程度之间存在反向关联。在重症患者中，SARS-CoV-2响应性CD8 T细胞的细胞毒性和炎症基因表达增强，TCR克隆扩增水平升高，支持过度激活的抗原特异性T细胞与COVID-19发病机制相关。由于体外刺激可以从根本上改变响应性T细胞的基因表达谱，进一步使用MHC多肽和单细胞测序的研究可以为SARS-CoV-2特异性T细胞的表型和功能提供进一步的见解。此外，单细胞多组学技术，如转座酶可及染色质单细胞测序(scATAC-seq)技术，可用于研究SARS-CoV-2特异性T细胞是否保留可能决定其记忆响应的表观遗传指纹（fingerprints）。
T细胞对COVID-19免疫的贡献：接触地方性冠状病毒和交叉响应性记忆T细胞免疫如何塑造对SARS-CoV-2的免疫应答，仍存在许多问题。细胞内细胞因子染色和流式细胞术、酶联免疫吸收斑点(ELISpot)和荧光斑点检测是检测未暴露于SARS-CoV-2的个体中交叉响应性记忆CD4 T细胞的关键单细胞技术，而交叉响应性记忆CD8 T细胞则不常见。据推测，交叉响应性记忆CD4 T细胞可能通过促进B细胞和抗体反应，或通过介导感染部位(包括肺部和上呼吸道)的快速局部抗病毒免疫，提供对SARS-CoV-2感染的保护性免疫，并降低疾病严重程度。然而，据报道，预先存在的交叉响应性记忆CD4 T细胞可能不仅具有低TCR，克隆扩张降低，而且还会加剧炎症和疾病严重程度，特别是在老年人中。因此，先前存在的交叉响应性记忆T细胞在一般人群中SARS-CoV-2感染和疫苗接种中的作用值得进一步研究。
5.单细胞水平的免疫保护相关因素
随着COVID-19免疫学单细胞数据集的快速增长，如何利用当前和新兴的公共数据集是医学家和研究者们面临的问题之一。正在进行的COVID-19候选疫苗疗效试验生成单细胞免疫图谱数据集，这些数据集可以被用于识别风险相关因素以及保护相关因素。由于COVID-19疫苗有效性试验的样本量有限，且有大量的免疫生物标志物可能被评估为相关因素，因此开展试点研究以优化和识别具有良好统计特性的相关分析方法和相关免疫特征至关重要。确定最佳相关性的重要因素包括:高可重复性、大规模的疫苗接种者、低假阳性率等。为加快相关分析，现有的单细胞数据集可以被用来优化和识别可重复性较高的单细胞免疫信号。
这些整理数据集的另一个主要应用是基于整合分析和meta分析识别可能参与SARS-CoV-2进展的相关因素等，例如最近对107个肺scRNA-seq研究的荟萃分析，发现可能参与SARS-CoV-2感染的蛋白酶。
图2展示出一种将公开可用的单细胞数据组织起来用于综合分析的方法。收集的21个数据集中个体的年龄(左)和性别(右)分布如图2a所示。组织类型的样本数量如2b所示。基于UMAP对来自于16个PBMC和全血来源的超过250万个单细胞映射到Seurat CITE-seq参考中，并通过参考定义的细胞类型对细胞进行着色和标记（图2c）。并基于Wilcoxon检验识别不同状态，不同症状程度，不同时间节点样本中CD4 T细胞、CD8 T细胞等细胞丰度间的差异（图2d）。
图2. 单细胞转录组数据的可视化表示
此外，研究者们对21个已发布的单细胞测序数据集(超过320万个细胞)进行整合概况，提供标准化、质量控制后可下载版本的数据以及UMAP映射图展示，并构建一个可用于数据探索的交互式可视化网站（https://atlas.fredhutch.org/fredhutch/covid）。
图3. 可视化网站示例
该网站提供特定数据集以及整合数据集探索分析。
提供相应数据集合的数据来源，组织来源，细胞类型等信息展示。
对于选定数据集合提供细胞，蛋白，基因搜索功能。
从而得到相应细胞中发生差异表达的基因。
以及相应蛋白或者基因的UMAP映射图。
COVID-19的单细胞数据有了，但是分析思路不清晰怎么办呢？别着急，下面小编将以两篇文章为例简单介绍下COVID-19单细胞免疫分析思路。
第一项工作为表征COVID-19患者的免疫学特征，研究者对13例新冠患者和5例健康捐献者（HDs）的PBMCs进行scRNA-seq分析，最终得到122,542个细胞的单细胞转录谱。并将13例COVID-19患者分为三种临床情况：中度(n=7)，重度(n=4)和恢复期（n=6例，其中4例与中度病例配对)，分析不同细胞条件下细胞组成，并进行差异基因分析以及B细胞，T细胞的亚型特点分析。此外，还对每个受试者进行单细胞T细胞受体(TCR)和B细胞受体(BCR)测序分析[2]。
COVID-19患者的免疫学特征分析
第二项工作通过对196名COVID-19患者和正常对照组的284份样本进行单细胞RNA测序，创建一个包含146万个细胞的全面免疫图谱。通过对免疫图谱数据进行分析，可以确定外周免疫亚型的变化与不同的临床特征相关，包括年龄、性别、严重程度和COVID-19的疾病分期。此外，SARS-CoV-2 RNA存在于多种上皮细胞和免疫细胞中，并伴有病毒阳性细胞的转录组学改变。外周血中主要由巨核细胞和单核细胞引起的S100A8/A9系统性上调可能会导致重症患者常见的细胞因子风暴[3]。
大规模COVID-19的单细胞免疫图谱
自21年下半年初始，COVID-19疫情在我国多点散发，颇有点“你方唱罢我登场”甚至想要的凶猛反扑的架势。冬奥临近，身为半个医学生的我们在小心谨慎，做好个人防护的同时，也别忘了对COVID-19致病机制和预防控制方面进行深入研究哦。
好啦，各位小伙伴，今天的内容就是这些，对COVID-19单细胞免疫分析感兴趣的朋友一定要认真学习下今天的这几篇文章哦，我们下次再见啦。
,
