知识体系
生物技术
1F理清微生物培养的5种基本技术
(1)培养基的制备：计算→称量→溶化→灭菌→倒平板。
(2)无菌技术：主要包括消毒和灭菌。
(3)倒平板操作：待培养基冷却至50℃左右时，在酒精灯火焰附近倒平板。
(4)平板划线操作：平板划线法是通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。注意划线的方法如下图。（马上点标题下蓝字"高中生物"关注可获取更多学习方法、干货）
(5)稀释涂布平板法：先将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，进行培养。在稀释度足够高的菌液里，聚集在一起的微生物将被分散成单个细胞，从而能在培养基表面形成单个的菌落。
2F明确微生物的筛选
(1)筛选原则：利用选择培养基，提供有利于目的菌生长的条件，同时抑制或阻止其他微生物的生长。
(2)两种菌株筛选、鉴别的比较
| 土壤中分解尿素的细菌 | 分解纤维素的微生物 |
| ①选择培养基的成分：尿素作为唯一的氮源②鉴定方法：在培养基中加入酚红指示剂，若pH升高，指示剂将变红，说明细菌能分解尿素 | ①选择培养基的成分：纤维素作为唯一的碳源②鉴定方法：刚果红染色法，即刚果红与纤维素形成红色复合物，当纤维素被分解后，培养基出现以纤维素分解菌为中心的透明圈 |
3F掌握统计微生物数目的方法
(1)显微镜直接计数法
①原理：利用特定细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下计算一定容积的样品中微生物的数量。
②缺点：不能区分死菌和活菌。
(2)间接计数法(活菌计数法)
①原理：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌，通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。
②计算公式：每克样品中的菌株数＝(C÷V)×M，其中，C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(mL)，M代表稀释倍数。
③操作：设置重复组，增强实验的说服力与准确性。同时为了保证结果准确，一般选择菌落数在30～300的平板进行计数。
4F理清4种传统发酵食品的技术
| 食品 | 菌种 | 呼吸类型 | 原理 | 温度 |
| 果酒 | 酵母菌 | 无氧 | 无氧呼吸产生酒精 | 18～25 ℃ |
| 果醋 | 醋酸菌 | 有氧 | 糖(酒精)→醋酸 | 30～35 ℃ |
| 腐乳 | 毛霉等 | 有氧 | 蛋白酶、脂肪酶水解蛋白质、脂肪 | 15～18 ℃ |
| 泡菜 | 乳酸菌 | 无氧 | 无氧呼吸产生乳酸 | － |
5F加酶洗衣粉的洗涤原理
| 种类 | 洗涤原理 | 洗涤实例 |
| 蛋白酶 | 可将蛋白质分解为易溶解或分散于洗涤液中的小分子的肽或氨基酸 | 血渍、奶渍及各种食品中的蛋白质污垢 |
| 脂肪酶 | 把脂肪水解为较易溶解的甘油和游离的脂肪酸 | 食品的油渍、人体皮脂、口红 |
| 淀粉酶 | 能使淀粉迅速分解为可溶性的麦芽糖、葡萄糖等 | 来自面条、巧克力等的污垢 |
| 纤维素酶 | 使纤维的结构变得蓬松，从而使渗入到纤维深处的尘土和污垢能够与洗衣粉充分接触，达到更好的去污效果 |
6F固定化酶和固定化细胞的比较
| 固定化酶 | 固定化细胞 | ||
| 固定酶的种类 | 一种 | 一系列 | |
| 适用方法 | 化学结合法、物理吸附法 | 包埋法 | |
| 特点 | 优点 | 酶既可与反应物结合，又可与产物分离，固定在载体上的酶可反复利用 | 成本低，操作容易 |
| 缺点 | 一种酶只能催化一种或一类化学反应 | 可能导致反应效率下降 | |
| 实例 | 固定化葡萄糖异构酶 | 固定化酵母细胞 |
7F三种生物成分的提取方法、原理及步骤的比较
| 提取物质 | 提取方法 | 提取原理 | 步骤 |
| 玫瑰精油 | 蒸馏法 | 利用水蒸气将挥发性较强的植物芳香油携带出来 | ①水蒸气蒸馏；②分离油层(加NaCl)；③除水过滤(加无水Na2SO4) |
| 橘皮精油 | 压榨法 | 通过机械加压，压榨出果皮中的芳香油 | ①石灰水浸泡、漂洗；②压榨、过滤、静置；③再次过滤 |
| 胡萝卜素 | 萃取法 | 使提取物溶解在有机溶剂中，蒸发后得到提取物 | ①粉碎、干燥；②萃取、过滤；③浓缩 |
8F血红蛋白的提取和分离的方法及原理
| 方法 | 原理 |
| 凝胶色谱法 | 根据相对分子质量的大小分离蛋白质 |
| 电泳法 | 利用了各种分子带电性质的差异以及分子本身大小、形状的不同，使带电分子产生不同的迁移速度进行分离 |
真题回放
1.（天津卷）天津独流老醋历史悠久、独具风味，其生产工艺流程如下图。
（1）在糖化阶段添加酶制剂需要控制反应温度，这是因为酶_____________________。
（2）在酒精发酵阶段，需添加酵母菌。在操作过程中,发酵罐先通气，后密闭。通气能提高____________的数量，有利于密闭时获得更多的酒精产物。
（3）在醋酸发酵阶段，独流老醋采用独特的分层固体发酵法，发酵30天。工艺如下。
①发酵过程中,定期取样测定醋酸杆菌密度变化,趋势如右图。据图分析，与颠倒前相比，B层醋酸杆菌密度变化的主要环境因素是__________________。
②乳酸含量高是独流老醋风味独特的重要成因。发酵过程中，发酵缸中____________层醋醅有利于乳酸菌繁殖，积累乳酸。
③成熟醋醅中乳酸菌的种类明显减少，主要原因是发酵后期营养物质消耗等环境因素的变化，加剧了不同种类乳酸菌的____________，淘汰了部分乳酸菌种类。
【答案】
（1）在最适温度条件下催化能力最强
（2）酵母菌
（3）①先快速增长后趋于稳定？氧气、营养物质、pH
②颠倒前的B层和颠倒后的A（或不翻动，或下）
③种间竞争（或竞争）
【解析】
(1)在糖化阶段添加酶制剂需要控制反应温度，因为酶在最适温度条件下催化能力最强。
(2)在酒精发酵阶段的操作过程中，发酵罐先通气，使酵母菌进行有氧呼吸大量繁殖，能提高酵母菌的数量，有利于密闭时获得更多的酒精产物。
(3)①醋酸杆菌是好氧菌，B层醋酸杆菌在颠倒后与空气中氧气接触后，大量繁殖，当B层中营养物质耗尽后，产生大量醋酸使pH减小，醋酸杆菌数量不再增加，所以密度变化的特点是先快速增长后趋于稳定。由此推测，影响醋酸杆菌密度变化的主要环境因素有氧气、营养物质、pH。
②乳酸菌是厌氧菌，所以发酵缸中颠倒前的B层和颠倒后的A(或不翻动，或下)层醋醅有利于乳酸菌繁殖，积累乳酸。
③发酵后期营养物质消耗等环境因素的改变，加剧了不同种类乳酸菌的种间竞争(或竞争)，淘汰了部分乳酸菌种类。
2.（2016全国课标Ⅰ卷.39）空气中的微生物在重力等作用下，可以一定程度地沉降。某研究小组欲用平板收集教室空气中的微生物，以了解教室内不同高度空气中微生物的分布情况。实验步骤如下：
①配置培养基（成分：牛肉膏、蛋白胨、NaCl、X、H2O）;
②制作无菌平板；
③设置空白对照组和若干实验组，进行相关操作；
④将各组平板置于37℃恒温箱中培养一段时间，统计各组平板上菌落的平均数。
回答下列问题:
（1）该培养基中微生物所需的氮来源于_________________。若要完成步骤②，该培养基中的成分X通常是_________________。
（2）步骤③中，实验组的操作是_________________。
（3）若在某次调查中，某一实验组平板上菌落平均数为36个/平板，而空白对照组的一个平板上出现了6个菌落，这种结果说明在此次调查中出现了_________________现象。若将30（即36-6）个/平板作为本组菌落数的平均值，该做法_______________（填“正确”或“不正确”）。
【答案】
（1）牛肉膏、蛋白胨琼脂
（2）将各实验组平板分别放置在教室不同高度的位置上，开盖暴露一段时间
（3）污染不正确
【解析】
(1)该培养基中微生物所需的氮来源于含氮物质牛肉膏、蛋白胨；若要完成制作平板，则培养基中的成分X通常是琼脂。(2)实验组各组构成对比实验，设计依据单一变量原则，结合实验目的，实验组的操作是将各实验组平板分别放置在教室不同高度的位置上，开盖暴露一段时间。(3)空白对照组的平板理论上不出现菌落，如果出现，说明在此次调查中出现了污染现象；既然实验中培养基制备中被杂菌污染，需要重新制备培养基进行实验，所以将30(即36－6)个/平板作为本组菌落数的平均值的做法是不正确的。
3.（2016四川卷.10）图甲是从土壤中筛选产脲酶细菌的过程，图乙是脲酶基因转录的mRNA部分序列。
（1）图中选择培养基应以为唯一氮源；鉴别培养基还需添加作指示剂，产脲酶细菌在该培养基上生长一段时间后，其菌落周围的指示剂将变成色。
（2）在5个细菌培养基平板上，均接种稀释倍数为105 的土壤样品液0.1mL，培养一段时间后，平板上长出的细菌菌落数分别为13、156、462、178和191。该过程采取的接种方法是，每克土壤样品中的细菌数量为×108个；与血细胞计数板计数法相比，此计数方法测得的细菌数较。
（3）现有一菌株的脲酶由于基因突变而失活，突变后基因转录的mRNA在图乙箭头所示位置增加了70个核苷酸，使图乙序列中出现终止密码（终止密码有UAG、UGA和UAA）。突变基因转录的mRNA中，终止密码为，突变基因表达的蛋白质含个氨基酸。
【答案】
（1）尿素酚红红
（2）稀释涂布平板法 1.75 少
（3）UGA 115
【解析】
(1)题中要从土壤中分离出产生脲酶的细菌，所用的选择培养基应以尿素为唯一氮源，要鉴别尿素分解菌，可在培养基中加入酚红指示剂，产脲酶细菌在该培养基上生长一段时间，由于产生的脲酶分解了尿素，产生氨，使培养基pH升高，所以菌落周围的指示剂变成红色。
(2)依据题意“均接种稀释倍数为105的土壤样品溶液0.1 mL，可知该过程采取的接种方法是稀释涂布平板法；根据计算公式：每克样品中菌数＝(C÷V)×M，其中C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板所用的稀释液的体积(mL)，M代表稀释倍数，为使结果接近真实值，一般选择菌落数在30～300的平板进行计数，菌落数为13和462的平板应舍弃，所以每克土壤样品中的细菌数量为[(156＋178＋191)÷3]÷0.1×105＝1.75×108个；因为稀释涂布平板法计数过程中，可能出现两个或多个细胞连在一起只形成一个菌落的情况，所以利用稀释涂布平板法统计的菌落数要比血细胞计数板计数法得到的数值低。
(3)在图中箭头处增加70个核苷酸，则图中从第271位开始的密码子(CUG)对应的氨基酸不变，增加的70个核苷酸和原序列中第274、275位的A、G正好构成24个密码子，对应24个氨基酸，而原序列中的从第276位开始的三个碱基即UGA正好组成一个终止密码子；通过分析可知，突变基因编码的蛋白质中含有(275＋70)÷3＝115个氨基酸。
4.（2016全国课标Ⅱ卷.39)苹果醋是以苹果汁为原料经发酵而成的，回答下列为题：
（1）酵母菌的呼吸代谢途径如图所示。图中过程①和②是苹果醋生产的第一阶段，在酵母菌细胞的_________________中进行，其产物乙醇与_________________试剂反应呈现灰绿色，这一反应可用于乙醇的检验；过程③在酵母菌细胞的________________中进行，与无氧条件相比，在有氧条件下，酵母菌的增值速度________________。
（2）第二阶段是在醋酸杆菌的作用下将第一阶段产生的乙醇转变为醋酸的过程，根据醋酸杆菌的呼吸作用类型，该过程需要在________________条件下才能完成。
（3）在生产过程中，第一阶段和第二阶段的发酵温度不同，第一阶段的温度____________（填“低于”或“高于”）第二阶段。
（4）醋酸杆菌属于___________核生物，其细胞结构中（填“含有”或“不含有”）线粒体。
【答案】
（1）细胞质基质 重铬酸甲 线粒体 快
（2）有氧
（3）低于
（4）原 不含有
【解析】
(1)酵母菌是真核生物，图中过程①和②是无氧呼吸，在酵母菌的细胞质基质中进行。在酸性条件下，重铬酸钾与乙醇反应呈灰绿色。过程③是丙酮酸的彻底氧化分解，在线粒体中进行。有氧条件下，葡萄糖氧化分解会产生更多能量，因此酵母菌增殖速度更快。
(2)醋酸杆菌是好氧型细菌，要在有氧条件下将乙醇转化为醋酸。
(3)制作果醋的第一阶段是酒精发酵，温度为18～25 ℃，第二阶段为醋酸发酵，温度为30～35 ℃，第一阶段温度低于第二阶段。
(4)醋酸杆菌是原核生物，没有线粒体。
5.（2016全国课标Ⅲ卷.39）某同学用新鲜的泡菜滤液为实验材料纯化乳酸菌。分离纯化所用固体培养基中因含有碳酸钙而不透明，乳酸菌产生的乳酸能溶解培养基中的碳酸钙。回答下列问题：
（1）分离纯化乳酸菌时，首先需要用_________________对泡菜滤液进行梯度稀释，进行梯度稀释的理由是_________________。
（2）推测在分离纯化所用的培养基中加入碳酸钙的作用有_________________和_________________。分离纯化时应挑选出_________________的菌落作为候选菌。
（3）乳酸菌在-20℃长期保存时，菌液中常需要加入一定量的_________________（填“蒸馏水”、“甘油”或“碳酸钙”）。
【答案】
（1）无菌水 泡菜滤液中菌的浓度高，直接培养很难分离得到单菌落
（2）鉴别乳酸菌 中和产生的乳酸 具有透明圈
（3）甘油
【解析】
(1)分离纯化乳酸菌需采用稀释涂布平板法，在稀释度足够高的菌液中，聚集在一起的微生物将被分散成单个细胞，从而在培养基上形成单菌落。为避免引入杂菌，必须用无菌水进行稀释。(2)据题意可知，只有乳酸菌能产生乳酸溶解碳酸钙，加入碳酸钙的培养基可作为鉴别培养基，便于对乳酸菌进行筛选鉴定；此外，加入碳酸钙也可中和产生的酸，有利于乳酸菌的生存。(3)细胞冻存时，加入保护剂甘油可使冰点降低，在缓慢的冻结条件下，能使细胞内水分在冻结前透出细胞外，可避免因细胞的机械损伤、电解质升高、渗透压改变、脱水、pH改变、蛋白质变性等因素导致细胞死亡。
6.（2016江苏卷.29）为了探索海藻酸钠固定化对绿球藻生长的影响，以及固定化藻对含Zn2 污水的净化作用，科研人员用筛选到的一株绿球藻进行试验，流程及结果如下。请回答下列问题：
（1）实验中的海藻酸钠作用是，CaC l2的作用是。
（2）为洗去凝胶球上残余的CaCl2和其他污染物，并保持绿球藻活性，宜采用洗涤。图1 中1. 0%海藻酸钠组培养24 h后,移去凝胶球,溶液呈绿色,原因是______________________。
（3）为探索固定化藻对含Zn2 污水的净化作用，应选用浓度为海藻酸钠制备凝胶球。
（4）图2中空白凝胶球组Zn2 浓度下降的原因是。结合图1和图2分析，固定化藻的实验组24~48h间Zn2 浓度下降速度较快的主要原因是；72~96h间Zn2 浓度下降速度较慢的原因有。
【答案】
（1）包埋绿球藻（包埋剂）与海藻酸钠反应形成形成凝胶球（凝固剂）
（2）培养液（生理盐水）海藻酸钠浓度过低（凝胶球孔径过大）
（3）2.0%
（4）凝胶球吸附Zn2 绿球藻生长（增殖）速度快绿球藻生长（增殖）速度减慢，溶液中Zn2 浓度较低
【解析】
(1)绿球藻相对较大，可用包埋法固定，实验中海藻酸钠的作用是作为包埋绿球藻的包埋剂；刚形成的凝胶球在CaCl2溶液中浸泡一段时间，有利于形成稳定的结构。
(2)刚固定好的凝胶球要用培养液冲洗2～3次，洗去凝胶球上残余的CaCl2和其他污染物；如果包埋用的海藻酸钠浓度较低，形成的凝胶球孔径过大，对绿球藻的包埋效果较差，培养过程中会有绿球藻从包埋材料中漏出来，使溶液呈绿色。
(3)分析图1可知，浓度为2.0%的海藻酸钠包埋绿球藻数量多，所以选用该浓度的海藻酸钠制备凝胶球。
(4)图2中空白凝胶球组Zn2＋浓度下降的原因是凝胶对Zn2＋有一定的吸附作用；固定化藻的实验组培养初期(24～48 h)绿球藻生长( 增殖) 速度较快，导致Zn2＋浓度下降较快；培养后期(72～96 h)Zn2＋浓度下降速度较慢的原因有绿球藻生长( 增殖)速度减慢，溶液中 Zn2＋浓度较低等。
7.（2016海南卷.30）回答下列问题：
（1）蛋白酶甲、乙、丙三者的活性随pH的变化如图所示。通常，用清水洗涤衣服上的新鲜血迹时，不应该使用开水，原因是_______________________。若要去除衣服上的血渍，应选择含有_____________________（填“蛋白酶甲”、“蛋白酶乙”或“蛋白酶丙”）的碱性洗衣粉，理由是___________________。
（2）某同学为了洗去衣服上的油渍，洗衣时在市售的蛋白酶洗衣液中添加脂肪酶，该同学的做法___________________（填“合理”或“不合理”），理由是_________________________。
（3）已知溶液的pH可以影响酶的活性，请推测pH影响某种蛋白酶活性的原因可能是其影响了酶和底物分子中_________________（填“羧基和氨基”、“氨基和甲基”、“羧基和甲基”或“甲基和甲基”）等基团的解离状态。
【答案】
（1）开水使血中的蛋白质变性而沉淀，难以清洗 蛋白酶丙 碱性条件下只有蛋白酶丙有活性
（2）不合理 蛋白酶会降解脂肪酶
（3）羧基和氨基
【解析】
（1）用清水洗涤衣服上的新鲜血迹时，如果使用开水，会使血中的蛋白质变性而沉淀，难以清洗。使用碱性洗衣粉去除衣服上的血渍，碱性条件下只有蛋白酶丙有活性，应选择含有蛋白酶丙的碱性洗衣粉。
（2）脂肪酶的化学成分为蛋白质，会被蛋白酶水解。
（3）蛋白酶和和其作用的蛋白质类污渍的氨基和羧基均会发生解离离，pH会影响其解离状态。
